| 腸球菌是醫院感染的重要病原菌 [1] ，對多種抗菌藥產生耐藥性，而且耐藥菌株不斷增加，接合轉移是導致腸球菌慶大霉素等耐藥基因轉移、耐藥性播散的重要原因，深入研究接合轉移試驗有助于了解腸球菌耐藥性的產生機理。我們研究了不同培養基和不同轉移方法對腸球菌質粒轉移試驗結果的影響，并對接合前后菌株的耐藥性進行了分析。 材料與方法 一、材料 1 ．菌株 (1) 供體菌 36 株高耐慶大霉素 (HLGR) 糞腸球菌， 15 株 HLGR 屎腸球菌， 1 株耐萬古霉素 (VER) 糞腸球菌均來自北京友誼醫院的臨床標本，所有菌株利福平 MIC 值均小于 32 μ g ／ ml 。 (2) 受體菌 糞腸球菌 JH2-2 ( 由 Don B ． Clewell 贈送，利福平 MIC>50 μ g ／ ml ，對慶大霉素、鏈霉素、青霉素、萬古霉素、氨芐西林、四環素、紅霉素、氯霉素敏感 ) ；本實驗室分離的金黃色葡萄球菌 S1106( 四環素 MIC128 μ g ／ m1) 、表皮葡萄球菌 S368( 利福平 MIC64 μ g ／ ml) 。 (3) 質控菌株 糞腸球菌 ATCC29212 、 ATCC51299 。 2 ．抗菌藥 慶大霉素 (Gm) 、鏈霉素 (Sm) 、青霉素（ Pen ）、利福平 (Rif) 、萬古霉素 (Van) 、氨芐西林 (Amp) 、四環素 (Tet) 、紅霉素 (Ery) 、氯霉素 (Chl) 等標準品購自中國生物藥品檢定所。 3 ．培養基 (1) 普通肉湯 (NB) 牛肉粉 10g 、牛肉胨 10g 、 K 2 HPO 4 · 3H 2 O 0.58g 、 NaCl 5g ，加水至 1000ml ，高壓滅菌備用。 (2) 心腦浸液粉 (BHI) 購自 BBL 公司。 4. BHI 選擇培養基 Gm ／ Rif 選擇培養基①： Gm500 μ g ／ ml ， Rif50 μ g ／ ml ； Gm ／ Rif 選擇培養基②： Gm500 μ g ／ ml ， Rif32 μ g ／ ml ； Gm ／ Tet 選擇培養基： Gm500 μ g ／ ml ， Tet64 μ g ／ ml ； Van ／ Rif 選擇培養基①： Van64 μ g ／ m1 ， Rif50 μ g ／ ml ； Van ／ Rif 選擇培養基②： Van64 μ g ／ ml ， Rif32 μ g ／ m1 ； Van ／ Tet 選擇培養基 ： Van64 μ g ／ ml ， Tet64 μ g ／ ml 。 5. PCR 相關試劑購自賽百盛公司、天為時代公司。 PCR 儀為美國 Biotronic 公司 AG-9600 型擴增儀。 6 ． Vitek — AMs 全自動微生物系統 (bioMerieux Vitek ， Inc ． ) 。 二、方法 1 ．菌株鑒定及藥敏試驗全部試驗菌株經 Vitek 全自動微生物系統鑒定，藥敏試驗按照 NCCLS 推薦 Kirby-Bauer 法進行，采用 2002 年 NCCLS 推薦瓊脂稀釋法，進行高耐慶大霉素 (MIC>500 μ g ／ m1) 、高耐鏈霉素 (MIC>2000 μ g ／ m1) 、耐萬古霉素 (MIC>6 μ g ／ m1) 的確證，以及利福平的 MIC 測定。 2 ．質粒接合轉移試驗 (1) 肉湯接合法 按參考文獻 [2] ，進行，將活化后的保存菌株用生理鹽水調制濁度為麥氏管 0.5 號，取 5 μ l 菌液于 1m 1 中不同的液體培養基：普通肉湯 (NB) 、普通肉湯加馬血清 (NBH) 、心腦浸液 (BHl) 、 BHI 加馬血清 (NBH) 。 35 ℃ 培養 4h ，取供體菌及受體菌各 20 μ l 、 60 μ l 按 1 ： 3 混合，加入到 2ml 相對應的液體培養基中， 35 ℃ 振蕩培養 4h ，離心后取少量沉淀培養物轉種于含抗菌藥物的 BHI 選擇培養基， 48h 觀察結果，有菌落生長者即為接合轉移成功。 (2) 濾膜接合法 按參考文獻 [3] 進行，將活化后的保存菌株用生理鹽水調制濁度為麥氏管 0.5 號，取 5 μ l 菌液于 lml 中液體培養基 35 ℃ 培養 4h ，取供體菌及受體菌各 20 μ l 、 60 μ l 按 1 ： 3 混合，直接涂布于滅菌的無菌濾膜 ( 孔徑 0.22 μ m) ，將濾膜置于 BHI 平板中， 35 ℃ 培養過夜，用 1mlBHI 肉湯沖洗濾膜，將沖洗液轉種于 BHI 選擇培養基， 48h 觀察結果，有菌落生長者即為接合轉移成功。 3 ．質粒 DNA 的提取：采用堿性裂解法 [4] ，裂解液 I 中不必加入溶菌酶，加入Ⅱ液后靜置時間延長至 7 ～ 10min 。 4. PCR 法檢測耐藥基因 檢測雙功能酶基因 aac( 6' )-apb( 2 ” ) 的引物 [5] 為 5' -TGA TGA TTT TCC TTT GAT GT — 3' 和 5' — CAA TCT TTA TAA GTC CTT TT -3' 。 20 μ l PCR 反應體系，擴增條件：預變性 94 ℃ 5min ，變性 94 ℃ 30s ，退火 52 ℃ 30s ，延伸 72 ℃ 60s ， 30 個循環，分別以 ATCC51299 和 ATCC29212 作為陽性和陰性對照。 結 果 1 ．糞腸球菌標準菌株 ATCC51299 、 ATCC29212 質控結果見表 1 。 表 1 糞腸球菌標準菌株在 8 種抗生素培養基上的生長結果 Gm(500 μ g/ml) 培養基 Rif(50 μ g/ml) 培養基 Gm/Rif 選擇培養基 ① Gm/Rif 選擇培養基 ② Gm/Tet 選擇培養基 Van/Rif 選擇培養基 ① Van/Rif 選擇培養基 ② Van/Tet 選擇培養基 ATCC51299 + — — — + — — — ATCC29212 — — — — — — — —注：“ + ”有菌落生長，“—”無生長。 2 ．質粒接合轉移試驗結果 (1)36 株糞場球菌耐藥質粒液體接合轉移和濾膜接合轉移試驗的結果見表 2 。 表 2 36 株糞腸球菌質粒接合轉移結果 轉移方法 培養基 供體菌數目 結合子數目 轉移通過率百分率（ % ） 肉湯接合法 NB 36 18 50 NBH 36 27 75 BHI 36 32 89 BHIH 36 32 89 濾膜接合法 BHI 36 36 100注：普通肉湯（ NB ）、普通內湯加馬血清（ NBH ）、心腦浸液（ BHI ）、 BHI 加馬血清（ BHIH ） (2) 使用 BHI 肉湯作為培養反應介質， 15 株 HLCR 屎腸球菌中無一株將 HLGR 耐藥性轉移至 JH2 — 2 。但通過濾膜接合法，有 14 株轉移成功。 (3) 使用 BHI 培養反應介質， VRE 腸球菌將對萬古霉素耐藥性轉移至 JH2 — 2 。 (4) 肉湯接合法、濾膜接合法均未能將 HLGR 、 VRE 的耐藥性從腸球菌屬轉移至金黃色葡萄球菌 S1106 、表皮葡萄球菌 S368 。 3 ． HLGR 糞腸球菌的供體菌與結合子藥敏試驗結果見表 3 ，表 4 。 36 株糞腸球菌均對 3 種以上抗菌藥耐藥， 36 ％ (13 ／ 36) 和 47 ％ (17 ／ 36) 的菌株對 4 種和 5 種以上抗菌藥耐藥。 表 3 HLGR 供體菌株及結合子的藥敏試驗結果 抗菌藥 供體菌（ 36 株） 結合子（ 36 株） 耐藥菌株數 耐藥百分率（ % ） 耐藥菌株數 耐藥百分率（ % ） 慶大霉素 36 100 36 100 鏈霉素 21 58 17 47 青霉素 11 31 1 3 氯霉素 20 56 13 36 氨芐西林 9 25 1 3 紅霉素 35 97 27 75 四環素 29 81 28 78 合計 36 364 ． PCR 耐藥基因檢測 在 36 株糞腸球菌及 14 株屎腸球菌供體菌及所形成的結合子中均檢測到了 aac( 6' )-aph( 2 ” ) 基因。 表 4 36 株糞腸球菌及結合子耐藥譜 菌株 編號 轉移前供體菌 轉移后結合子 抗菌藥 抗菌藥 Sm Gm Pen Chl Tet Amp Ery Sm Gm Pen Chl Tet Amp Ery 1 R R R R R R R R R R R R 2 R R R R R R R R R 3 R R R R 4 R R R R R R R R R 5 R R R R R R R R R 6 R R R R R R R R R 7 R R R R 8 R R R R R R R 9 R R R R R R R R 10 R R R R R R R R R R 11 R R R R R R R 12 R R R R R R R R R R 13 R R R R R R R R 14 R R R R R R 15 R R R R R R R R R R 16 R R R R R R R R R 17 R R R R R R R R 18 R R R R R R R R 19 R R R R R R R R R R 20 R R R R R R R R 21 R R R R R R R R R R 22 R R R R R R R R 23 R R R R R 24 R R R R 25 R R R R R R R 26 R R R R R R R R 27 R R R R R R R R 28 R R R R R R R 29 R R R R R R R R R 30 R R R R R R R R R R 31 R R R R R R R R R R R 32 R R R R R R R 33 R R R R 34 R R R R R R R R 35 R R R R 36 R R R R R R R R R注：“ R ”耐藥 討 論 本次試驗中分離到的 36 株 HLGR 糞腸球菌，全部多重耐藥。對紅霉素的耐藥率最高 (97 ％ ) ，四環素次之 (81 ％ ) ，鏈霉素和氯霉素分別為 58 ％和 56 ％，氨芐西林與青霉素的耐藥率相對較低。實驗所選的 7 種抗菌藥物中，所有菌株對三種或三種以上抗生素耐藥， 47 ％的菌株對五種及五種以上抗菌藥物耐藥。 100 ％的糞腸球菌將 HLGR 的耐藥性轉移到了受體菌 JH2-2 ，并伴有其他耐藥性的同時轉移，大多數抗菌藥的耐藥性都可通過接合方式轉移到受體菌，氨芐西林與青霉素的耐藥性轉移也遠低于其他抗菌藥。但伴隨四環素、紅霉素、鏈霉索耐藥性轉移的比例較大，而針對青霉素、氨芐西林的耐藥性同時轉移的比例較小。可見，慶大霉素、鏈霉素、紅霉素、四環素的耐藥基因位于同一個接合型轉移單位的機率大于青霉素、氨芐西林的耐藥基因。 通過試驗證明接合轉移是腸球菌耐藥性轉移的重要方式，接合轉移試驗是研究腸球菌耐藥性轉移的重要方法。 根據文獻報道 [6] 信息素應答質粒可在肉湯 ( 液體 ) 中有效轉移，其主要存在于糞腸球菌中。通過普通肉湯、普通肉湯加馬血清、 BHI 、 BHI 加馬血清四種培養基作為接合反應前、接合反應中的培養基的比較，發現普通肉湯作為培養基時轉移通過率 (50 ％ ) 最低．而普通肉湯加馬血清、 BHI 或 BHI 加馬血清作為培養基時轉移通過率相對提高，分別為 75 ％、 89 ％。實驗結果證明，按合效率隨營養條件的改善而提高，但在營養較充足時，轉移效率便不再受之影響。在接合反應過程中使反應體系保持適當的振動，可以使腸球菌分散均勻，增加潛在供體菌與受體菌的接觸機會，提高結合效率。接合反應結束時，適當離心，取沉淀反應物轉入選擇培養基，以防止轉移頻率過低時，所取菌液中不含結合子。 在供體菌與形成的結合子中均檢測到了 aac( 6 ' ) — aph( 2 ” ) 基因，證明接合轉移試驗方法可靠。 對于非信息素應答質粒、接合性轉座子的接合反應，在液體中很難轉移，一般需在固體表面進行，如濾膜接合法。 15 株屎腸球菌肉湯接合試驗雖然沒有成功，但濾膜接合試驗卻有 14 株轉移成功。同時， 4 株糞腸球菌在肉湯中未轉移的質粒也都通過濾膜接合法轉移成功。濾膜為接合反應的細菌提供了穩定、持久的接觸表面，促進了接合反應的進行。 無論是通過肉湯接合法，還是濾膜接合法， HLGR 及 VER 的耐藥性都未能從腸球菌轉移至表皮葡萄球菌 S386 和金黃色葡萄球菌 S1106 ，有可能轉移較困難，仍需做進一步的試驗進行觀察。但近年的研究表明，腸球菌中的多種耐藥性來自于葡萄球菌屬。 參考文獻 1. N.Kobayashi,Md.Mahbub Alam,Y.Nishimoto,et al.Distribution of aminoglycoside resistance genes in recent clinical isolates of enterococcus faecalis,Enteroccus faecium and Enterocccus avium.Epidemiol.infect.2001,126 ： 197-204 2. Dunny, G.M.R.A.Craig,R.L.Carron,and D.B.Clewell. Plasmid transfer in Streptococcus faecalis ： production of multiple sex pheromones by recipients.Plasmid.1979,2 ： 454-465. 3. Werner G,Willems RJ,Hildebrandt B,et al, Influence of transferable genetic determinants on the outcome of typing methods commonly used for Enterococcus faecium.Journal of Clinical Microbiology.2003,41 ： 1369-1506. 4. 盧圣棟主編 . 現代分子生物學實驗技術 . 第二版 . 中國協和醫科大學出版社， 1999 ； 109-115. 5 ． Swenson JM,Ferraro MJ,Sahm DF,et al. Multilaboratory evaluation of screening methods for detection of high-level aminoglycoside resistance in enterococci. National Committee for Clinical Laboratory Standards Study Group on Enterococci.J Clin Microbiol. 1995,33 ： 3008-18. 6. Wirth R.Sex pheromones and gene transfer in Enterococcus faecalis.Res Microbiol.2000 ， 151 ： 493-6. 摘自《臨床檢驗及實驗室設備》 2005 年 6 月第七卷第 2 期 |