毛細管電泳色譜儀的檢測技術

毛細管電泳色譜儀（CE）是以毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅動力，利用荷電粒子之間的淌度差異和分配系數差異進行分離，是分析科學繼液相色譜儀之后的又一重大進展，使分析科學從微升級進入到了納升級水平，不僅使單細胞乃至單分子分析成為可能，也使蛋白質和核酸等生物大分子分析有了新的轉機。

由于CE溶質區帶的超小體積特性導致光程太短，圓柱形毛細管作為光學表面不夠理想，對檢測器靈敏度要求相當高。當然在CE中也有有利于檢測的因素。如在HPLC中，因稀釋之故，溶質到達檢測器的濃度一般是其進樣端原始濃度的1%。但在CE中，經優化實驗條件后，可使溶質區帶到達檢測器時的濃度和在進樣端開始分離前的濃度相同。CE中還可采用堆積進樣等技術使樣品達到柱上濃縮效果，使初始進樣體積濃縮為原體積的1%～10%，這對檢測十分有利。因此，從檢測靈敏度的角度來說，HPLC具有良好的濃度靈敏度，CE具有很好的質量靈敏度。檢測是CE中的關鍵問題，發展很快，迄今為止，除了原子吸收光譜、電感藕合等離子體發射光譜和紅外光譜未用于CE外，其它檢測手段均已用于CE。

一、紫外檢測器：

紫外檢測器是基于物質對紫外吸收進行檢測，是最成熟的檢測器，在CE中應用zui廣。

檢測下限為10ˉ⁶～10ˉ⁵mol/L。

1、原理：

入射紫外光通過樣品時，被吸收的多少符合朗伯－比耳定律。

檢測點在毛細管的末端，檢測點的毛細管的外涂層要燒掉。

2、檢測方法：

（1）固定波長：

光源為低紫外氘燈，用濾光片獲得固定波長的光。

（2）可變波長：

光源為氘燈或鎢燈，用單色器（棱鏡或光柵）獲得連續可調波長的光。

（3）快速掃描：

1）利用線性二極管陣列快速捕獲紫外光。

2）利用硅光電倍增管作快速掃描。

（4）間接測定：

紫外間接測定是在緩沖液中加入有紫外吸收的添加劑，溶質因無紫外吸收而產生倒峰。

可解決許多直接檢測所不能解決的問題，主要用于離子分析。

3、特點：

（1）通用性好，特別是對蛋白質的適用性很強。

（2）靈敏度不足。

4、提高靈敏度的方法：

由于CE檢測池的光路長度為毛細管內徑，一般不超過100μm，小內徑的毛細管限制了紫外檢測器的靈敏度，可采用以下幾種方法來提高靈敏度。

（1）優化測定波長：

通過測定不同波長下的信噪比來選擇zui優測定波長，以提高靈敏度。

（2）減少檢測噪音：

1）提高光源強度。

2）采用聚焦和狹縫等減少背景光的影響。

3）采用良好的信號放大系統。

（3）擴展吸光光路長度：

1）為了克服圓柱形毛細管表面引起的散射、失真等不利的光學特性和增加光路長度，可采用矩形、扁形、Z形和泡型等特殊毛細管。當然柱效會有所下降。

2）對于普通毛細管，可采用軸向照射和多次反射來增加光路長度。

①軸向照射：將激光光束從毛細管末端沿管軸方向入射，在毛細管側面進行檢測。

②多次反射：在毛細管壁鍍上銀，分別開入射窗和出射窗。當入射光以特定角度入射后，在毛細管內反射30～40次后從出射窗口射出。

二、激光誘導熒光檢測器：

激光誘導熒光檢測器采用激發光源使檢測物質產生熒光進行檢測。

檢測下限為10ˉ¹²～10ˉ¹⁰mol/L。

三、質譜檢測器：

在CE－MS聯用中，毛細管區帶電泳最為常用。電子噴霧離子源可檢測多種高質量的帶電分子，從CE分離出來的分子經過接口后直接進入MS，是MS的離子源。

檢測下限為10ˉ⁹～10ˉ⁷mol/L，通用性好，可獲得溶質的結構信息，但接口復雜。

四、電化學檢測器：

電化學檢測器可避免光學類檢測器遇到的光程太短的問題，是CE中zui靈敏的檢測器之一。

1、電導檢測器：

柱上電導檢測是在毛細管壁上用激光鉆兩個孔，插上兩根鉑電極，再將孔封住進行檢測。

檢測下限為10ˉ⁷～10ˉ⁵mol/L，通用性好，但需專門裝置和毛細管處理。

2、安培檢測器：

CE中微量樣品可使庫侖效率大大提高，可達40%以上，而在HPLC中很少超過10%。

檢測下限為10ˉ⁹～10ˉ⁸mol/L，靈敏度高，選擇性好，但僅適用于電活性物質的檢測。

五、激光熱透鏡檢測器：

物質受到光子幅射后產生與之相關的溫度場，引起密度、折射指數、應力等各種光、熱和機械性能的變化（光熱效應），對這些參數進行測定可獲得物質的組成和結構信息。

激光照到毛細管后，導致毛細管內樣品受熱，溫度升高，不同的溫度形成折射指數的梯度分布，類似一光學透鏡，使另一束探測激光產生散焦或偏轉，測定此散焦或偏轉可進行定量分析。

檢測下限為10ˉ⁸～10ˉ⁵mol/L。

六、激光誘導毛細管振動檢測器：

激光照射到毛細管產生的光熱效應誘導毛細管局部熱膨脹，發生彈性振動，振幅正比于樣品的吸收，并能使另一探測激光產生偏轉。

檢測下限為10ˉ⁷mol/L。

七、拉曼光譜檢測器：

激光束聚焦到毛細管上，產生的散射光由一束圍繞著毛細管的光纖引導到拉曼光譜儀的接收器上，即構成了拉曼光譜檢測器。

檢測下限為10ˉ⁷～10ˉ⁵mol/L，可獲得溶質的結構信息。

八、化學發光檢測器：

化學發光檢測器靈敏度高，結構簡單，近年來引起重視。

檢測下限為10ˉ⁹mol/L，適用于生物體系和臨床化學樣品的檢測。

九、示差折光檢測器：

示差折光檢測器的信號正比于樣品濃度的變化，而不是正比于樣品濃度本身。由于CE中形成的塞式流，使區帶邊界產生極大的濃度改變，可測定折射率的變化。

檢測下限為10ˉ⁷～10ˉ⁵mol/L，簡單易行，適用面廣。

十、同位素檢測器：

同位素檢測器選擇性高，靈敏度高。測定時需標記同位素，檢測β或γ射線。

檢測下限為10ˉ⁹～10ˉ⁷mol/L。