全球慢性乙型肝炎病毒(HBV)攜帶者約4億，亞太地區是全球HBV的高發區[1]。在我國臨床各類(約103種)肝病中，病毒性肝病占一半以上；病毒性肝病中，乙型肝炎占80%以上。一般人群HBsAg攜帶率為7.18%。據此推算，我國現有的慢性HBV感染者約9 300萬例，其中慢性乙型肝炎患者約2 000萬例[2]。HBV感染時的年齡是影響慢性化的最主要因素。
HBV是一種雙鏈DNA病毒，病毒基因組松弛環狀DNA(rcDNA)、共價閉合環狀DNA(cccDNA)、前基因組RNA(pgRNA)是該病毒復制周期中重要的中間體，其中cccDNA的產生和存在是現有抗病毒手段難以根治乙肝的主要因素[3]。
HBV感染標志物檢測對于臨床診斷、病程監測、療效判斷、預后分析等具有重要價值。目前臨床常用的HBV感染標志物檢測主要包括病毒抗原檢測和核酸檢測(含基因分型和突變)。這些標志物在臨床的正確應用和解讀是臨床檢驗人主動參與臨床乙型肝炎及其相關疾病診治的關鍵。
一、HBsAg
HBsAg是一分泌性包膜蛋白，與肝組織中cccDNA、總HBV–DNA相關[4,5]，而cccDNA是病毒復制的模板并維持HBV的慢性感染狀態，因此HBsAg可作為肝細胞感染HBV的一個重要標志物。在CHB病程中，HBsAg在免疫耐受期含量最高，在免疫清除期開始下降，在HBeAg血清學轉換后下降緩慢。最近已經進入臨床應用的定量HBsAg檢測對于臨床預測長效干擾素治療應答反應具有臨床價值HBsAg在療效監測中雖然不能替代HBV–DNA，但聯合HBV–DNA可較早地預測療效。血清中HBsAg的清除(seroclearance)是歐洲肝病學會(EASL)等慢性肝病防治指南中提出的理想治療終點[6]，HBsAg被清除的CHB通常預后較好。值得注意的是盡管HBsAg攜帶者HBsAg自發性清除發生率約0.5%/年，抗病毒治療的理想終點是HBsAg消失，但在HBsAg消失的個體中，有約一半以上者血清中仍可持續出現低水平HBVDNA。在HBsAg清除后數年的個體仍然會發生肝癌，這種情況特別見于年長或者在HBsAg清除前已經發生肝硬化的患者。
目前已經進入臨床應用的HBsAg定量檢測敏感度在0.05 IU/ml，新的線性HBsAg檢測定量系統，敏感性已達到0.005 IU/ml，2013年已經通過了日本FDA的批準[7]。采用敏感方法進行HBsAg等檢測將有利于臨床隱匿性肝炎的診斷、獻血源篩選以及原發性肝癌發病監測。
二、病毒核心蛋白HBeAg與HBcAg
HBeAg是HBV基因組中C區基因編碼的非結構性分泌蛋白，研究表明HBeAg是否發生血清學轉換與患者的年齡、ALT水平和HBV基因型有關[8]。越早發生HBeAg轉換或者HBeAg陽性期越短，治療緩解的幾率越高。當然臨床上還應重視前C區G1896A變異，臨床判斷是否出現血清學轉換或判斷HBV攜帶者時應關注這種變異。
在抗病毒治療的適應證掌握上，e抗原是否陽性，具有不同的治療策略[2,6,8,9]。HBeAg陰性CHB治療后復發率高。因此最好選擇干擾素類或耐藥發生率低的核苷(酸)類抗病毒藥物治療。
目前已有商業化HBeAg定量檢測系統，研究表明，在長效干擾素PegIFNα–2a的治療過程中，定量監測HBeAg水平對治療應答有較好地預測價值。
HBcAg則是HBV病毒衣殼的結構蛋白，來自于pgRNA。由于HBeAg和HBcAg具有149氨基酸序列相同的片段，因此有文獻將兩者統稱為HBV核心相關抗原(HBcrAg)，已采用全自動化學發光檢測[10]。研究表明HBcrAg的檢測可以作為有創性肝組織cccDNA檢測的替代檢查，用于預測治療后的復發及監測CHB病程。與丙型肝炎病毒核心抗原的檢測類似，HBcrAg檢測需要前處理將HBcAg從病毒中釋放，同時也能解聚抗原抗體復合物，從而提高檢測效率。目前國內臨床尚沒有常規開展HBcrAg的檢測，該指標較現有標志物的可能優勢，特別是與肝內cccDNA檢測的相關性及其動態應用價值尚有待進一步評價。
三、HBV核酸定量、基因分型及突變檢測
HBV DNA定量檢測是臨床判斷病毒復制水平的直觀指標，也是判斷療效的有價值指標，與HBsAg定量檢測聯合應用對于預測抗病毒療效具有一定臨床意義。近年CFDA已經明確規定新申請注冊的HBV DNA檢測試劑的分析靈明度應不低于30 IU/ml，較既往500 IU/ml的標準有了顯著提高。目前國內HBV DNA定量檢測基本以使用國產試劑為主，但30～100 IU/ml的臨床檢測性能，部分國產試劑的重復性、準確性尚有待提高。
HBV基因分型及其多耐藥位點分析，是臨床實現個體化用藥及疾病轉歸預測、制定個體化隨訪方案的重要依據。最新報告提示HBV至少具有10種基因型，我國以C性和B型為主。HBV耐藥包括了基因型耐藥、表型耐藥、交叉耐藥。依據這三種耐藥的定義，目前進入臨床檢測的屬于基因型耐藥和交叉耐藥。EASL指南提供的交叉耐藥信息主要包括了拉米夫定、替比夫定、恩替卡韋、阿德福韋和替諾福韋五個藥物[6]。
在耐藥突變檢測的臨床應用中，筆者實驗室對現有的幾種已得到CFDA批準的方法(膜芯片、硅芯片、測序)進行了比對，非常遺憾結果一致性較差。一代測序作為"金"標準，具有結果可靠、除特定耐藥位點外，可以發現未知突變等優點，但敏感性不足，通量低，且操作繁瑣：需要兩次PCR、兩次PCR產物純化、PCR產物凝膠電泳定量等，對設備、操作者以及防污染等要求較高，耗時長(1.5 d)；芯片雜交法雖敏感性有所提高，但待測位點的覆蓋、特異性、準確性等均有待提高。在多區突變檢測中，本實驗室前期采用一代測序及二代測序法(NGS)對HBV相關原發性肝癌患者肝臟組織HBV全基因組研究，發現了一些高頻、不同于文獻報道的已知突變。此外，文獻及本實驗室研究均發現部分位點的變異對現有乙肝標志物檢測結果存在影響，例如：C3116T、C1653T突變與HBeAg、C3116T突變與HBV–DNA載量、Pres/S區突變/缺失與HBsAg等[5,11]。了解、掌握這些新進展，對于有效臨床溝通，提升臨床檢驗服務內涵具有重要意義。
二代測序運用于突變檢測具有較一代測序更大的優勢，特別在低豐度變異以及突變頻率、分析通量及病毒復雜度計算等方面[12]。
HBV基因變異除了目前臨床作為基因型/亞型分型以及抗病毒藥物耐藥位點分析的依據外，還可以用作HBV相關肝病病理轉歸(如肝硬化、肝癌)的預測或輔助早期診斷[13]。最新研究在HBsAg/HBsAb雙陽性患者的HBsAg主要親水區中發現了多個突變位點導致的氨基酸替換(aa 113，114，116，123，129，130，131)，新糖基化位點，使HBsAg與HBsAb的結合減弱，且突變后的病毒包膜形成及病毒分泌能力更強[14]。且這一突變可以在人群中橫向傳播，可導致疫苗保護失敗或者慢性感染患者的重復感染。HBV基因的這些突變對未來乙型肝炎防控提出了更大挑戰。
目前有關HBV基因研究的另一個熱點是病毒基因整合至宿主基因的研究，NGS技術的出現和發展為該研究提供了強大的技術支撐。HBx–人基因嵌合轉錄本及嵌合蛋白可能與肝癌的發生發展有關[15,16]。因此這些整合后的嵌合基因及其產物檢測的臨床意義和未來應用值得探索。
四、問題和思考
基于臨床檢驗診斷學特征，綜合四大臨床指南(中國、亞太、歐洲、美國)，結合國內國情和目前相關研究進展，目前與CHB及其相關疾病臨床管理中乙肝感染標志物檢測相關的主要問題建議關注以下問題。
臨床應用上，HBsAg、HBeAg的定量檢測在臨床制定治療策略及其療效監測中的作用有多大？HBV基因分型是否應該作為檢測常規納入基于干擾素等抗病毒治療的常規檢測方案中？基因分型是否需要細化至亞型及其臨床管理應用價值？此外，新的交叉耐藥位點的認識和發現、多種HBV熱點突變對于預測或輔助診斷肝癌、肝硬化以及疾病進展的作用、HBV–人基因嵌合體檢測的臨床意義等均需要進一步擴大驗證和評價。
檢測技術上，國產HBV核酸定量檢測低濃度區(<100 IU/ml)的穩定性和準確性亟待提高；現有的HBV基因突變特別是耐藥位點檢測方法學的敏感性、準確性及流程可操作性尚難以滿足臨床應用，亟待進一步優化；NGS技術用于HBV基因突變及其頻率分析中的質量控制、測序后數據分析、臨床應用等，有待在應用中不斷完善。
我國是一個肝病大國，乙肝發病人群基數大，不同地區醫療水平差異大，如何將有限的醫療資源最大化現實意義重大。我國作為乙型肝炎的重災區，國家在十一五、十二五都給予了較大的投入，但在關鍵檢測技術的自主研發、轉化上仍與歐洲一些發達國家以及美國、日本存在較大差距。如何縮短差距、加快研究轉化和國產化，我們檢驗人任重而道遠。（參考文獻：略）