手性物質的分離分析方法有手性源合成法、結晶拆分法、化學拆分法、酶拆分法、膜拆分法、萃取拆分法和色譜拆分法等，常與離心機分離技術結合使用。
1、手性源合成法：
手性源合成法是以單一對映體的手性化合物為原料合成另外的手性化合物的單一對映體，這是化學家常用的方法。
由于原料的立體結構決定著產物的立體構型，獲得制備所需對映體的手性原料是關鍵。但天然手性物質的品種和數量有限，滿足不了實際需求。利用天然手性物質衍生出所需的手性化合物，反應步驟較多，難度較大。
2、結晶拆分法：
結晶拆分法是基于對映體與手性物質形成非對映體鹽或共價衍生物，然后利用非對映體的性質差異進行分離（如分級結晶），再將衍生物還原為對映體。
結晶拆分法分為晶體機械拆分法和接種結晶拆分法。
晶體機械拆分法是將外消旋混合物從溶液中結晶析出，依據兩種對映體結晶形態的差別，從結晶物中進行手工分離。這一方法耗時費力，僅能應用于實驗室研究。
接種結晶拆分法是采用加入純對映體之一的晶種，將附在播入的晶種上的同種對映體析出的分步結晶分離方式。
雖然結晶拆分法操作簡單，但要耗費大量的時間、勞力和物力，而其實驗與預期存在很大偏差，因此應用不廣泛。
3、化學拆分法：
化學拆分法是通過化學反應的方法，即用手性試劑將外消旋體中的兩種對映體轉化為非對映異構體，然后利用非對映異構體之間物理化學性質的不同將二者拆分開。拆分成功的關鍵是選擇合適的拆分劑，合適的拆分劑應該是能夠與對映體生成非對映異構體，且溶解度差別較大，經拆分后，易再生為原來的對映體。
雖然這種方法一直被作為重要的拆分方法，但其局限性也很明顯：
（1）拆分劑和溶劑的選擇較為盲目。
（2）拆分的產率和產品的對映純度不高。
（3）適用于手性拆分的對映體的類型不多。
4、酶拆分法：
酶對光學活性異構體有選擇性地進行酶解作用，使外消旋體中一種光學異構體酶解較快，而另一種酶解較慢，或不發生酶解，在適當的條件下被保留而達到分離。
酶拆分的主要途徑為主體選擇性水解、酶化和轉酶作用。
酶催化的副反應很少、產率高、反應的條件較為溫和，酶無毒、易降解、不會造成環境污染。但該法僅能適用于酶促反應體系，酶制劑品種有限，酶易被破壞不穩定，制劑的價格較高，阻礙了其應用發展。
5、膜拆分法：
液膜拆分法是將具有手性選擇能力的載體溶解在某種液體溶劑中，通過與某個異構體特異性的結合，將其從上相轉移到下相，從而實現對映體的分離。但是由于液膜穩定性較差，其工業應用一直受到很大的限制。
為了克服液膜的不穩定性，固膜得到了很大的發展。固膜拆分法是不同的對映體通過選擇性擴散或吸附來完成跨膜過程。選擇性擴散固膜一般不帶特殊的手性拆分劑，形成選擇性擴散的原因是一種異構體比另一種異構體在固膜中更容易擴散。選擇性吸附固膜主要是利用嵌在聚合物母體中的手性拆分劑與對映體之間特殊的分子間作用來進行手性拆分，通常一種異構體被較多的選擇性吸附在手性拆分劑上，而另一種異構體則較多的游離在聚合物母體之中。