實驗方法：環狀DNA-seq, RNA-seq（云序生物提供以上服務）
1. ecDNA是環狀結構
為了了解ecDNA的結構，作者通過環狀DNA-seq（云序生物提供以上服務）方法研究了三種人類癌細胞系和來自于TCGA的臨床腫瘤樣品。通過這種方法檢測到了GBM39細胞中的圓形擴增子游離于染色體之外，并且超高分辨率共聚焦顯微鏡下能夠觀察這些擴增子環狀結構。
圖1 ecDNA是環狀結構
2.eccDNA驅動大量癌基因表達
為了研究eccDNA對轉錄的影響，作者又對樣品進行了RNA-seq（云序生物提供此項服務），并將DNA-seq數據與RNA-seq數據進行聯合分析。發現eccDNA是癌基因中表達豐度最高的基因之一。作者在DNA-seq和RNA-seq數據中分析了單核苷酸多態性，進一步區分了轉錄本來源（eccDNA還是原染色體），發現eccDNA編碼的轉錄本大量增加。這些數據說明eccDNA能夠驅動癌基因表達。
圖2 eccDNA驅動癌基因的高表達
3.eccDNA的染色質具有高度開放性
每個人都攜帶原癌基因，但是由于人體中DNA會壓縮折疊，因此在一般情況下，這些原癌基因是不表達的。該研究發現，在eccDNA上面，染色質的結構是高度開放的，所以這些環狀DNA（大部分是原癌基因），幾乎都能被順利轉錄為mRNA，且大量表達。
圖3 eccDNA的染色質是高度開放的
4. eccDNA支持超長距離染色質接觸
DNA序列之間會因其折疊而產生相互作用，從而調控基因表達。而這種調控，會隨著DNA間的空間距離的增大而降低。但是，eccDNA是環狀結構，這會導致原本相距很遠的DNA片段，會被連接到一起，從而能夠實現超遠距離的相互作用和基因調控。這毫無疑問會破壞某些DNA表達調控機制，也有可能導致某些基因的異常表達。
圖4 eccDNA支持超長距離染色質接觸
案例二
實驗方法：環狀DNA-seq、Chip-seq、RNA-seq（云序生物提供以上服務）
1.EGFR聯合兩種增強子在膠質母細胞瘤中高表達
在膠質母細胞瘤中，致癌基因EGFR普遍高表達，當EGFR的拷貝在腫瘤中積累時，它們傾向于形成環狀DNA的結構，與染色體分離。作者通過環狀DNA-seq（云序生物提供此項服務）發現染色體外環狀DNA（eccDNA）中包含致癌基因EGFR，分析發現EGFR周圍序列上游存在兩個增強子，且共同擴增的增強子在膠質母細胞瘤中非常活躍，可調節EGFR表達，提高細胞適應性。
圖1 EGFR聯合兩種增強子在膠質母細胞瘤中高表達
2.EGFR與鄰近增強子共擴增事件存在于eccDNA上
為了了解EGFR增強子在其擴增中的作用，作者選擇了9種膠質母細胞瘤細胞培養并擴增EGFR。通過Chip-seq（云序生物提供此項服務）發現，盡管EGFR增強子具有異質性，但兩種EGFR增強子元件在9種膠質母細胞瘤中均得到了持續擴增。在膠質母細胞瘤中，作者使用原位雜交技術，證明EGFR基因經常會從染色體脫落而產生eccDNA。
圖2 EGFR與鄰近增強子共擴增事件存在于eccDNA上
3.染色體外DNA的增強子重排可以調節細胞活力
為了定量分析這些存在于EGFR非擴增和擴增細胞中的互作聯系對腫瘤細胞的適應性的意義，作者設計了針對超過100個互作區域的共10000個sgRNA的CRISPRi篩選，在經過21天的篩選期后對sgRNA進行定量可準確地反映相應細胞群體的活性程度。結果發現，包括兩個上游鄰近增強子在內的多個在擴增后新獲得的互作增強子都對EGFR擴增腫瘤細胞活性具有很強的正向效應。上述結果表明，腫瘤細胞中的癌基因通過高級擴增與環化而形成的對自身調控活性的增強，是一個十分有效的促癌機制。
圖3 EGFR的增強子重排促進細胞活力
4. 細胞起源增強子與多種腫瘤中的癌基因共同擴增
最后，作者為探究這種現象的普遍性，在多種癌種的樣本中做了同樣的分析，發現不同實體腫瘤類型中均存在類似的癌基因與增強子顯著共擴增的現象。例如，MYCN在神經母細胞瘤和腎母細胞瘤中分別于3’端和5’端的超級增強子發生共擴增，而這些增強子的活性在相應的起源組織中具有最高的活性。
圖4 多種癌癥中癌基因與增強子共擴增分析
總結
以上研究都表明大量的癌基因并不在染色體上，而是會從染色體上脫落下來，形成eccDNA，它的大量表達與癌癥的發生發展息息相關。由于eccDNA在腫瘤中廣泛存在，因此，解析其結構與功能，將有助于后續一系列問題的研究，包括eccDNA是如何產生，如何復制，以及如何運動的。只要找到腫瘤維持eccDNA穩態的機制，我們甚至有辦法研發出一種通用的抗腫瘤策略，即直接靶向eccDNA進行抗腫瘤治療，因此關于eccDNA的研究意義重大，而高通量測序是研究eccDNA的一大利器。