（一）原理：
用于生物染色的染料主要有堿性染料、酸性染料和中性染料三大類。堿性染料的離子帶正電荷，能和帶負電荷的物質結合。因細菌蛋白質等電點較低，當它生長于中性、堿性或弱酸性的溶液中時常帶負電荷，所以通常采用堿性染料（如美藍、結晶紫、堿性復紅或孔雀綠等）使其著色。酸性染料的離子帶負電荷，能與帶正電荷的物質結合。當細菌分解糖類產酸使培養基pH下降時，細菌所帶正電荷增加，因此易被伊紅、酸性復紅或剛果紅等酸性染料著色。中性染料是前兩者的結合物又稱復合染料，如伊紅美藍、伊紅天青等。
簡單染色法是只用一種染料使細菌著色以顯示其形態，簡單染色不能辨別細菌細胞的構造。
革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學家C.Gram所創立的。革蘭氏染色法可將所有的細菌區分為革蘭氏陽性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G—）兩大類，是細菌學上最常用的鑒別染色法。該染色法所以能將細菌分為G+菌和G—菌，是由這兩類菌的細胞壁結構和成分的不同所決定的。G—菌的細胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質，而且肽聚糖層較薄、交聯度低，故用乙醇或丙酮脫色時溶解了類脂質，增加了細胞壁的通透性，使初染的結晶紫和碘的復合物易于滲出，結果細菌就被脫色，再經蕃紅復染后就成紅色。G+菌細胞壁中肽聚糖層厚且交聯度高，類脂質含量少，經脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細菌仍保留初染時的顏色。
（二）器材
1、菌株：培養12-16h的蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis）或者枯草桿菌（Bacillus subtilis），培養24小時的大腸桿菌（Escherichia coli）
2、染色液和試劑：結晶紫、盧哥氏碘液、95%酒精、蕃紅、復紅、二甲苯、香柏油
3、器材：廢液缸、洗瓶、載玻片、接種杯、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡
（三）革蘭氏染色方法：
1、以酒精擦拭玻片，在酒精燈上干燥后，用接種環挑取一環滅菌的去離子水或生理鹽水到載玻片上，挑取少量純培養物在水滴上涂抺至均勻分散，將涂片在酒精燈火焰上滅活、固定。
2、滴加結晶紫染色液1-2 滴，染1 分鐘，用去離子水輕輕水洗。
3、待干，滴加革蘭氏碘液，作用1 分鐘，用去離子水輕輕水洗。
4、滴洗脫色劑（95%酒精），不時搖動玻片，直至無紫色脫落為止（約10～20 秒），用去離子水輕輕水洗。
5、待干，滴加沙黃復染液，復染30 秒。用去離子輕輕水洗，待玻片干燥后鏡檢。
6、油鏡鏡檢。菌體呈紫色者為革蘭氏陽性菌；呈紅色者為革蘭氏陰性菌。
（四）注意事項
1.革蘭氏染色成敗的關鍵是酒精脫色。如脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而染成陰性菌；如脫色時間過短，革蘭氏陰性菌也會被染成革蘭氏陽性菌。脫色時間的長短還受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影響，難以嚴格規定。
2.染色過程中勿使染色液干涸。用水沖洗后，應吸去玻片上的殘水，以免染色液被稀釋而影響染色效果。
3.選用幼齡的細菌。G+菌培養12h-16h，E.coli培養24h。若菌齡太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉呈陰性反應。