質粒提取的方法和影響因素

發布時間：2020-02-05 21:40 原文鏈接：質粒提取的方法和影響因素

質粒是攜帶外源基因進入細菌中擴增或者表達的重要媒介，這種基因運載工具在基因工程中具有極廣泛的應用價值，質粒提取是分子生物學最常見的實驗之一。目前質粒提取實驗大多借助試劑盒來完成，那么關于質粒提取的原理，您的了解足夠深入嗎？

目前，質粒提取試劑盒最常用的方法是堿裂解法。堿裂解法原理：根據共價閉合環狀DNA與線性DNA的拓撲學結構差異來分離的。在強堿環境下，細菌的細胞壁和細胞膜被破壞，基因組DNA和質粒DNA被釋放出來，線性DNA雙螺旋結構被破壞而發生變性。雖然在強堿的條件下共價閉合環狀質粒DNA也會發生變性，但兩條互補鏈仍會互相盤繞，并緊密的結合在一起。當加入高鹽緩沖液使pH恢復中性時，共價閉合環狀質粒DNA復性快，而線性的染色體DNA復性緩慢，細菌蛋白質、破裂的細胞壁和變性的染色體DNA會相互纏繞成大型復合物。這樣，通過離心可沉淀大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質，再采用吸附柱對質粒進行吸附、去雜質、洗脫，就完成了質粒提取的實驗。

在進行質粒提取實驗室，有時候質粒提取的濃度不高，達不到后續進行轉化或轉染的實驗要求，那么可能是哪些原因造成的呢？下面跟隨星博士一起來看一下質粒提取有哪些影響因素吧！了解它的影響因素，就能夠做出相應的實驗方案調整，從而得到更高濃度的質粒樣本啦！

影響質粒提取的因素：

質粒提取的得率和質量與很多因素有關，如宿主菌的種類和培養條件、細胞的裂解、質粒拷貝數、質粒的穩定性、抗生素等。

宿主菌的種類和培養條件

多數情況下宿主菌為大腸桿菌，而菌株的不同會影響質粒提取的質量。例如，HB101及其衍生菌株（TG1、JM系列）會在裂解時產生大量的糖類，如果沒有完全去除，將抑制后續實驗中的酶活性，影響質粒DNA提取的質量。

由于無質粒的子細胞在無抗生素時復制速度遠大于含質粒的細胞。因此，宿主菌株接種到液體培養基中培養的過程中，務必加入抗生素進行篩選。宿主菌接種到含相應抗生素的液體培養基中，振蕩培養12-16小時，不應超過16小時。超過16小時后，細胞開始裂解，使得質粒的得率降低，也可能導致質粒丟失或質粒變異。

不同質粒間的差異

質粒提取最終的濃度，最重要的影響因素之一就是質粒拷貝數。質粒拷貝數是指生長在標準的培養基下每個細菌細胞中所含有的質粒DNA分子的數目，每個細菌中的質粒的拷貝數主要決定于質粒本身的復制特性。

按照復制機制，可以把質粒分為兩類：一類是嚴緊型質粒，當細菌染色體復制一次時，質粒也復制一次，每個細菌內只含1-2個質粒；另一類是松弛型質粒，當細菌染色體復制停止后仍然能繼續復制，每一個細菌內一般含20個左右質粒拷貝，這些質粒的復制是在寄主的松弛控制之下的。高拷貝質粒與低拷貝質粒在相同條件下進行質粒提取，高拷貝質粒濃度會高于低拷貝質粒的濃度。不同拷貝數的質粒，菌液量的需求不同，對于低拷貝的質粒，要相應增加菌液的量。

在細菌培養液中加入氯霉素可提高松弛型質粒的拷貝數。因為氯霉素能抑制宿主細胞蛋白質和DNA的合成，但對松弛型質粒的復制沒有影響。由于氯霉素抑制了宿主細胞蛋白質和DNA的合成，從而抑制了染色體的復制，但質粒復制所用的酶半衰期較長，故質粒仍可繼續復制，這樣既可增加質粒產量，又可降低細胞的數量，使細菌裂解液的粘度降低而便于操作。氯霉素的使用濃度為20-170ug/ml，使用氯霉素能在一定程度上提高質粒提取的濃度。

質粒鑒定與評價：

瓊脂糖電泳檢測：

堿裂解法提取的質粒經瓊脂糖電泳進行鑒定時，理想狀況是只出現超螺旋—條帶，但在質粒提取過程中，由于機械力、酸堿度、試劑等原因，使質粒DNA鏈發生斷裂，可能出現兩條帶或者出現三條帶，這三條帶電泳遷移率從快到慢，分別是超螺旋、開環和復制中間體(即沒有復制完全的兩個質粒粘連在—起)。

如果加溶液Ⅱ后過度振蕩，會在遠離這三條帶的位置出現條帶，這條帶泳動得較慢，是大腸桿菌基因組DNA的片斷，因此要注意加完P2、P3后輕柔混勻。質粒提取是否有基因組污染，可以進行單酶切驗證，酶切后有單一條帶，就證明質粒提取的產物是單一的。

濃度及純度測定：

用紫外線分光光度計檢測濃度測定標準為：OD 260 值為1相當于大約50ug/ml雙鏈DNA。OD 260 /OD 280 比值在1.7-1.9之間說明所得DNA純度較好。OD 260 /OD 280 比值若低于1.7說明可能有蛋白污染。OD 260 /OD 280 比值若高于2.0則說明DNA有可能已降解。