此外，抗體阻斷試驗顯示，用MjpIgR免疫的蝦中vp28的表達降低，表明抗MjpIgR抗體阻斷了血細胞和腸膜上的結合位點（圖2H）。 綜上所述，這些結果提示MjpIgR促進了蝦中WSSV的增殖。為進一步探討其功能，以Trx-His標簽mRNA為對照，通過MjpIgR mRNA注射進行了MjpIgR的過表達。 在mRNA注射后24小時，MjpIgR過表達組的血細胞和腸中成功表達了MjpIgR蛋白（圖2I）。 然后用WSSV攻擊蝦。 與Trx-His標簽mRNA組相比，MjpIgR過表達組的WSSV增殖顯著增加（圖2J）。 通過測試WSSV拷貝數，在腸中獲得了相似的結果（圖2K）。 抗VP26抗體檢測到的WSSV蛋白質水平在血細胞和腸中增加（圖2L）。 通常，這些數據表明MjpIgR促進了蝦中WSSV的增殖。
圖2 MjpIgR促進WSSV 在蝦體內增殖
WSSV感染后，MjpIgR寡聚為四聚體并被內化到血細胞的細胞質中
為了分析MjpIgR在WSSV增殖中的可能機制，檢測了MjpIgR寡聚和內在化。首先使用天然PAGE分析重組MjpIgR（rMjpIgR）的寡聚，結果表明rMjpIgR在體外形成了不同的寡聚體（圖3A）。進一步的研究表明，天然MjpIgR形成了四聚體，由WSSV體內攻擊后的分子量決定（圖3B）。我們進行了免疫細胞化學檢測，使用抗MjpIgR抗體檢測MjpIgR的亞細胞定位。在正常條件下，MjpIgR主要位于細胞膜上（圖3C頂部面板）。 WSSV攻擊后，隨著攻擊時間從15分鐘增加到60分鐘，MjpIgR逐漸從表面移至細胞質（圖3C）。這些結果表明，MjpIgR的內在化可能與WSSV的胞吞作用有關。我們使用蛋白質印跡進一步分析了血細胞膜和細胞質中的MjpIgR。結果表明，隨著WSSV攻擊時間的增加，血細胞膜中的MjpIgR水平略有下降。然而，其水平在各時間點之間沒有顯著差異（圖3D左圖）。WSSV感染后血細胞的細胞質中MjpIgR水平顯著增加（圖3D右圖）。這些結果表明，MjpIgR從膜內化到細胞質中，這種內在化可能與WSSV的內吞作用有關。pbe1突變體幼苗比野生型幼苗對鹽和ABA處理更敏感。
MjpIgR與WSSV在血細胞中共定位
為了確定WSSV的內吞作用是否需要MjpIgR的內在化，進行了免疫細胞化學分析以檢測MjpIgR與WSSV的共定位。在WSSV注射后15分鐘觀察到MjpIgR與Dil標記的WSSV的共定位（圖4A），并且共定位速率從15分鐘增加到60分鐘，并且WSSV在60分鐘時移至核周位置（圖4B）。結果表明MjpIgR可能是WSSV的受體，它參與了蝦WSSV的胞吞作用。 為了進一步證實結果，在MjpIgR的RNA干擾后進行了流式細胞儀。 結果顯示，在MjpIgR的RNAi后，血細胞中WSSV顆粒的內在化速率降低了（圖4C和4D）。 這些結果表明，WSSV的內吞作用需要在蝦血細胞中內化MjpIgR，而MjpIgR可能是WSSV的受體。
圖4 MjpIgR與WSSV在血細胞中共定位。
創新點
在本研究中，我們確定了WSSV進入和感染的關鍵受體MjpIgR。 MjpIgR的胞外域可與WSSV包膜蛋白VP24相互作用，而胞間域可與MjCaM相互作用。 MjCaM招募了Mjclathrin和AP-2銜接子復合體，這些復合體也與病毒進入有關。因此，WSSV通過pIgRCaM-網格蛋白內吞途徑進入宿主細胞。從日本支原體獲得的MjpIgR序列具有三個免疫球蛋白結構域，并且是IgSF的成員。作為細胞粘附分子，IgSF是細胞表面或可溶性蛋白質的大蛋白超家族，參與細胞的識別，結合或粘附過程。通過BLAST分析，觀察到日本分枝桿菌的IgSF成員與法西林分子，尤其是法西林III相似。但是，通過域結構比較（S1圖），我們發現Fasciclin I包含Fas 1（Fascilin樣）域，Fasciclin II包含Ig和FN3（纖連蛋白3型）域，而Fasciclin III包含Ig或Ig樣域，除了跨膜圖案。與聚合免疫球蛋白受體（pIgR）相比，IgSF成員的結構域來自日本分枝桿菌與脊椎動物pIgR非常相似。系統發育分析還表明，日本血吸蟲的IgSF成員與脊椎動物的pIgR相似。
因此，我們將來自庫魯瑪蝦的IgSF命名為pIgR樣蛋白（MjpIgR）。在本研究中，攜帶WSSV顆粒的MjpIgR作為WSSV的受體進入血細胞并引起蝦的全身感染。包括pIgR在內的大多數IgSF成員是I型跨膜蛋白，其包含細胞外結構域（包含一個或多個） Ig樣結構域），單個跨膜結構域和胞質區域。這些IgSF蛋白可以通過其N端Ig樣結構域介導粘附，該結構通常會結合細胞表面上具有相同結構的其他Ig樣結構域，或者與其他分子（例如整聯蛋白和碳水化合物）相互作用。這表明IgSF分子可以形成均聚物。在我們的研究中，我們發現MjpIgR在體內形成四聚體并與WSSV的VP24相互作用。
幾類分子被包括唾液酸部分和整聯蛋白在內的各種病毒利用作為受體。特別是，許多IgSF蛋白（例如pIgRs）已被鑒定為病毒受體，例如HIV受體（T細胞表面糖蛋白CD4），主要的鼻病毒受體（細胞內粘附分子-1）以及脊髓灰質炎病毒受體和腺相關病毒病毒受體。在我們的研究中，我們發現MjpIgR與WSSV的VP24相互作用，并且被WSSV用作其進入細胞的受體。