銀杏葉有廣泛生物活性,含有多種化學成分,主要包括黃酮類、萜類、多糖類、酚類、有機酸、生物堿、氨基酸、甾體化合物、微量元素等。其中,維生素C、維生素E、胡蘿卜素以及鈣、磷、硼、硒等礦物元素含量也十分豐富,但最主要 藥用價值成分是黃酮類和萜類。黃酮類和萜類具有擴血管、抗氧化等多方面的作用。
銀杏提取物(Ginkgo Biloba Extract,GBE),指的是從銀杏中提取的有效物質,含有銀杏總黃酮,銀杏內酯等物質。有擴張血管,保護血管內皮組織、調節血脂、保護低密度脂蛋白、抑制PAF(血小板激活因子),抑制血栓形成、清除自由基等作用。大量的臨床研究表明,銀杏葉標準提取物可以大大的減少患者的精神疾病,如,阿茲海默氏癥。
天然產物常常被認為可以天然的糾正和改善人們的健康系統。不幸的是競爭氛圍導致最終市場上假冒偽劣產品的出現。銀杏提取物中的有效活性成分為黃酮甙和帖類。這些成分在銀杏標準提取物里的含量分別為≥24%和≥6%。目前普通的分析方法都有水解的步驟。這一水解步驟會將黃酮甙轉化為甙元,而很多甙元在銀杏原植物中是不存在的。而這些甙元如槲皮素、山奈酚、異鼠李素卻用在了銀杏產品的質量控制上,這些不合適的質量控制指標給銀杏提取物的摻假提供了可乘之機。藥典提供了一些復雜的分析方法,目的是規范化植物產品,包括原料,提取物和最終的植物商品。對于銀杏的規定,美國藥典,英國藥典,歐洲藥典,中國藥典都有各自的檢測方法,都要求銀杏黃酮甙的含量在22.0%~27.0%之間。但是對于水解的銀杏樣品,各自藥典對于液相檢測甙元的峰比要求稍有不同。美國藥典規定,山奈酚/槲皮素峰比為≥0.7,異鼠李素/槲皮素峰比為≥0.1。2010版藥典規定山奈酚/槲皮素峰比為0.8~1.2,異鼠李素/槲皮素峰比為≥0.15。英國藥典和歐洲藥典對峰比沒有規定,他們僅規定黃酮甙的含量在22.0%~27.0%之間,白果內酯含量在2.6%~3.2%之間,銀杏內酯A,B,C的含量在2.8%~3.4%之間,并且銀杏酸不超過5ppm。盡管美國藥典,英國藥典,歐洲藥典,中國藥典在銀杏產品的質量控制方面提供了重要的規則,但是這些規定不能提供一種方法來分析有酸水解工藝的產品。有一個例外,中國醫藥保健品進出口商會提出,有水解工藝的銀杏中,蘆丁≤4%,槲皮素≤0.5%,山奈酚≤0.5%,異鼠李素≤0.2%,這里邊同樣規定了山奈酚/槲皮素峰比為≥0.7。美國藥典在USP 37-2S增補版中增加了蘆丁和槲皮素的規定,然而卻對山奈酚和異鼠李素沒有規定。盡管這些規定對市場上銀杏的規范化起到了一定的作用,但是這些都不能很好的對有酸水解工藝產品中的甙元和其他成分進行監測。這些都導致了摻假銀杏的泛濫。
銀杏摻假常常有以下幾種情況,最常見的一種摻假是加入特殊的原植物提取物或添加一定比例的黃酮甙和甙元來達到黃酮24%的要求。蘆丁、槲皮素、山奈酚、異鼠李素是最常用的成分,另一種摻假是使用銀杏的其他部位,如,根、皮或種子。
上面所提到到摻假中,用富含黃酮的其他原料是最常用的摻假。槐角和槐米就富含有蘆丁和槲皮素,但是,同時含有染料木素和染料木甙,這兩種成分在銀杏提取物中是不含有的。如果用槐角或槐花摻假,就會在銀杏提取物中檢測到這兩種成分。
銀杏葉
銀杏葉提取物
液相鑒別方法
1.溶液制備
對照品溶液:蘆丁,槲皮素,山奈酚,異鼠李素,染料木素,染料木甙用甲醇配制成合適的濃度,這一濃度可以作為定量用。
樣品溶液:銀杏提取物的濃度為12mg/mL(甲醇)。銀杏葉原料為100mg/mL(甲醇)。
1g銀杏葉原料粉末用甲醇混勻后,懸浮液超聲1小時。商品化的產品要經過換算成為120mg的提取物。對于商品化的膠囊和片劑,稱樣量要換算成相對于80mg的黃酮甙至10mL的容量瓶用甲醇超聲140分鐘。所有的樣品進樣前都要經過微孔濾膜過濾。
水解的樣品是根據USP 37-NF 32來制備,和未水解的樣品用同樣的方法來分析。具體方法為:取銀杏提取物0.3g至250mL圓底燒瓶中,加78mL混合溶劑(甲醇:鹽酸:水=50:20:8;V/V/V)回流提取135分鐘(液體變為深紅色),放涼至室溫,轉移至100mL容量瓶,加水稀釋至刻度,搖勻。取液體過微孔濾膜進行液相分析。
2.液相條件
安捷倫1200液相色譜儀。
Luna C18-HST色譜柱(2.7μm,3×100mm)
流動相 A:水 B:乙腈。流速1.0mL/min。
梯度洗脫:0-1.5min,15-15%B;3-4min,17-17%B;7-14min,20-35%B;
檢測波長:260nm,360nm。
進樣量:1μL
每個樣品平衡5min。
槲皮素,山奈酚,異鼠李素的相對保留時間分別為1.00min;1.17min和1.20min。
3.液相圖譜結果
圖7為銀杏葉原料,圖28為銀杏標準提取物
圖8摻有蘆丁,槲皮素,山奈酚和異鼠李素的銀杏提取物
4.結果討論
對于銀杏葉提取物是否摻假,可以采用以下步驟進行判斷:
用不水解的檢測方法對樣品檢測
①如果樣品中出現有13個甙元的峰,每個峰之間的峰高和原料基本接近,且無染料木甙、染料木素、槲皮素、山奈酚和異鼠李素的峰,即可判斷此樣品為沒有摻假;
②沒有黃酮甙峰出現的樣品,其首先判斷為此銀杏產品生產工藝采用的酸水解,但其需要滿足蘆丁≤4%,槲皮素≤0.5%,山奈酚≤0.5%,異鼠李素≤0.2%的要求,且無染料木素,染料木甙的峰,則可認定為有酸水解工藝的真的銀杏提取物;
③用酸水解的方法對銀杏樣品進行檢測;
④用山奈酚/槲皮素和異鼠李素/槲皮素峰的比值作為判斷依據;
⑤不摻假的銀杏提取物中,山奈酚/槲皮素峰比為0.8~1.2,異鼠李素/槲皮素峰比為≥0.15;
薄層鑒別方法
1.薄層鑒別條件
薄層板:硅膠G60,10×10cm。
樣品制備:1.0g+10mL 70%乙醇,超聲30分鐘。
點樣量:10μL。
展開劑:乙酸乙酯-甲酸-冰乙酸-水(100:11:11:26,V/V/V/V)。
展距:8cm。
檢測:
先噴A試劑:二苯硼酸-2-氨基乙酯甲醇溶液(10g/L);
再噴B試劑:聚乙二醇400甲醇溶液(50g/L)后,略加熱至斑點清晰,在366nm和可見光下檢測。
2.薄層鑒別圖譜
1.銀杏提取物(摻假產品);2.銀杏葉原料;3.銀杏標準提取物(中檢院);4~7.銀杏提取物(摻假產品);8.槐角提取物;9.槐角(加酸水解);
3.結果討論
從薄層圖譜中可以看到,摻假的銀杏提取物中會明顯出現槐角水解物的特征斑點或者槐角的特征斑點。
小結
銀杏提取物市場存在很多的摻假物,用液相和薄層的方法可以快速清楚的對銀杏提取物的真假進行鑒別。