數字PCR的前世今生：特點、優勢和局限性

數字PCR即Digital PCR（dPCR)，它是一種核酸分子絕對定量技術。相較于qPCR，數字PCR可讓你能夠直接數出DNA分子的個數，是對起始樣品的絕對定量。

數字PCR是近年來迅速發展起來的一種定量分析技術。該技術結果判定不依賴于擴增曲線的循環閾值（Ct），不受擴增效率的影響，具有很好的準確度和重現性，并且可以實現絕對定量分析。數字PCR已經在核酸檢測、鑒定等研究領域顯示出巨大的技術優勢和應用前景。本推送主要介紹dPCR的歷史和發展、dPCR的基本原理和商業化dPCR平臺及其特點。

簡介

在定量PCR時，我們常常糾結一個問題，究竟是相對定量還是絕對定量呢？如今，你無需糾結了，因為數字PCR（digital PCR）來了。盡管這兩種技術有些類似，都是估計起始樣品中的核酸量，但它們有一個重要的區別。定量PCR是依靠標準曲線或參照基因來測定核酸量，而數字PCR則讓你能夠直接數出DNA分子的個數，是對起始樣品的絕對定量。因此特別適用于依靠Ct值不能很好分辨的應用領域：拷貝數變異、突變檢測、基因相對表達研究（如等位基因不平衡表達）、二代測序結果驗證、miRNA表達分析、單細胞基因表達分析等。

dPCR的歷史和發展

數字PCR即Digital PCR（dPCR)，是一種核酸分子絕對定量技術。相較于qPCR，數字PCR能夠直接讀出DNA分子的個數，是對起始樣品核酸分子的絕對定量。dPCR起源于Cetus Corporation于1988年首次發表的方法，當時研究人員證明可以通過PCR檢測和擴增單個β-珠蛋白分子。這是通過將樣品分開來完成的，因此某些反應包含該分子，而另一些則不包含。1990年，Peter Simmonds和AJ Brown首次使用此概念對分子進行量化。Alex Morley和Pamela Sykes于1992年正式建立了該方法作為核酸的定量技術。

1999年，Bert Vogelstein創造了“數字PCR”一詞，文章正式報道于美國科學院院刊PNAS，并表明該技術可用于發現罕見的癌癥突變。作者是美國癌癥研究者、霍華德·休斯醫學研究所研究員貝爾特·福格爾斯泰因（Bert Vogelstein）。

通過將一個樣本分成幾十到幾萬份，分配到不同的反應單元，每個單元至少包含一個拷貝的目標分子( DNA 模板) ，在每個反應單元中分別對目標分子進行PCR 擴增，擴增結束后對各個反應單元的熒光信號進行統計學分析。

文章通過在結腸癌患者糞便中檢測KRAS基因突變，并重點突出了dPCR定量檢測的能力和潛力（由于PCR是一個指數過程，因此qPCR只能觀察到兩倍的擴增差異，文章卻重點突出了dPCR區別這種微小差異的能力）。但文章僅僅把樣本分配到384孔板中，分別用不同熒光檢測突變基因和正常基因，通過計算突變基因和正常基因的比例來得出突變率。盡管為了能夠提高檢測性能需要將樣本分配到更多的微孔或液滴中，但基本的思想都離不開Bert Vogelstein所建立的dPCR理念。

2003年，Kinzler和Vogelstein繼續完善dPCR，并創建了一種改進的方法，他們將其稱為BEAMing技術，即“珠子，乳狀液，擴增和磁性”的首字母縮寫。BEAMing技術使用乳狀液在單個試管中分隔擴增反應。這一變化能在一次運行中將該PCR擴展到成千上萬的反應。

自此，關于dPCR兩種形式（芯片式和液滴式）的基本方法都已經建立，dPCR商業化方面，Bio-Rad、LIFE Technologies及RainDance等廠家相繼推出技術較為成熟的數字PCR產品。

QuantaLife公司開發出的微滴數字PCR技術。該產品還獲得了2011年度Frost & Sullivan北美新產品創新獎。2011年10月，Bio-Rad公司收購了QuantaLife和ddPCR技術，相繼推出了QX100、QX200微滴式數字PCR系統。

dPCR的基本原理

目前dPCR主要有兩種形式，芯片式和液滴式，但基本原理都是將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應器或微滴中，每個反應器的核酸模板數少于或者等于1個。這樣經過PCR循環之后，有一個核酸分子模板的反應器就會給出熒光信號，沒有模板的反應器就沒有熒光信號。根據相對比例和反應器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度。

可以使用幾種不同的方法來分配樣品，包括微孔板，毛細管，油乳劑和帶有核酸結合表面的小型化腔室陣列。樣品的分配使人們可以通過假設分子種群遵循泊松分布來估計不同分子的數量，根據泊松分布的原理，反應體系中目標分子的拷貝數可以通過公式A=-ln[(N-X)/N]*N計算，從而解決了多個目標分子存在于單個液滴中的可能性。

同時，從公式也可以看出，隨著反應陽性體系數（X）的增加，體系中目標分子的拷貝數相對于X會有較大的差距，隨著X的持續增加，數字PCR結果的不確定度也隨著提高，總體來說，數字PCR陽性體系的數量不得超過總體系數量的80%。另一個方面，N的增加會使整個數字PCR體系具有較大的線性范圍，并可以提高反應的靈敏度、穩定性以及可重復性。因此，目前dPCR都需要在成本可控的情況下，增加分配的腔室數和液滴數。

商業化dPCR平臺及其特點

發展到現在，市面上常見的dPCR主要有兩種：微滴式dPCR（droplet dPCR，ddPCR）和芯片式dPCR（chip dPCR，cdPCR）技術。由于芯片式dPCR制造芯片的成本較高，目前微滴式dPCR正越來越受到企業的認可。

cdPCR（芯片式）主要以Fluidigm公司的BioMark HD系統以及Life Technology公司的QuantStudio 3D系統為代表。Bio Mark系統采用微泵閥式芯片，以聚二甲基硅氧烷為芯片材料，主要依靠微流控通道與閥門的開閉進行原始體系分割，在芯片的反應倉進行PCR反應，然后通過類似于基因芯片的方法掃描每個通孔的熒光信號，進行目的序列含量的計算。QuantStudio 3D系統采用陣列微池式芯片，反應液由進樣孔直接進入各微反應池。芯片式dPCR生成微滴體積均一，具有較高的穩定性，體系之間影響較小，但技術操作復雜，通量有限且實驗成本較高。

ddPCR（微滴式）主要有Bio-rad公司開發的QX200系統和Rain Drop系統，QX200可以將體系分割成2萬個微滴，Rain Drop可以分割成100萬-1 000萬個微滴。ddPCR原理是通過將一個待分析的PCR反應體系進行微滴化處理，利用微滴發生器制成近20 000個油包水小微滴從而對原始體系進行分割，樣品中的核酸分子隨機分配到大量獨立的微滴中，每個微滴中含有一個或不含待檢核酸分子。對微滴體系進行擴增反應以后，分析每個微滴的熒光信號，進行有或無的判斷，將判斷結果按照泊松分布的原理，通過讀取靶標和內參核酸的陽性微滴個數以及比例從而得到靶分子的拷貝數及濃度。與芯片式dPCR相比，操作簡單，可以實現高通量的檢測，也保證一定程度上的微滴檢測穩定性。

Bio-Rad基因表達部門的銷售經理Richard Kurtz表示，該公司ddPCR的獨特優勢是能夠產生非常均一、重復的1納升液滴。這樣的好處是每個樣品形成20,000個液滴，而其他系統只能分成760-3,000個部分。分得越多，則意味著分析越準確。 

數字PCR的優勢

數字PCR是一種核酸分子絕對定量技術。當前核酸分子的定量有三種方法：（1）光度法基于核酸分子的吸光度來定量；（2）實時熒光定量PCR（Real Time PCR）基于Ct值，Ct值就是指可以檢測到熒光值對應的循環數；（3）數字PCR是最新的定量技術，基于單分子PCR方法來進行計數的核酸定量，是一種絕對定量的方法。主要采用當前分析化學熱門研究領域的微流控或微滴化方法，將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應器或微滴中，每個反應器的核酸模板數少于或者等于1個。這樣經過PCR循環之后，有一個核酸分子模板的反應器就會給出熒光信號，沒有模板的反應器就沒有熒光信號。根據相對比例和反應器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度。

與常規的PCR的方法相比，dPCR有很好的優勢。

絕對定量

常規PCR和實時熒光PCR定量檢測都需要已知拷貝數的標準DNA制定標準曲線，由于樣品測定在各種條件上不會完全一致，會造成PCR擴增效率的差異，從而影響定量結果的準確性。而ddPCR不受標準曲線和擴增動力學影響，可以進行絕對定量。

樣品需求量低

在檢測珍貴樣品和樣品核酸存在降解時具有明顯的優勢。

高靈敏度

ddPCR本質上是將一個傳統的PCR反應分成了數萬個獨立的PCR反應，在這些反應中可以精確地檢測到很小的目的片段的差異、單拷貝甚至是低濃度混雜樣品，且能避免非同源異質雙鏈的形成。

高耐受性

由于目的序列被分配到多個微滴中，顯著降低了體系間的影響以及背景序列和抑制物對反應的干擾，擴增基質效應大大減小。

具體每種PCR的對比如下表所示：

于此同時，dPCR也有一些缺點，數字PCR系統成本高，通量有限、操作繁瑣等不足。芯片式dPCR由于芯片加工成本高，系統復雜度高，使得商業化優勢不是特別明顯，特別是目前大多數分子診斷qPCR也能夠很好的滿足需求，dPCR增加的收益成本比并不算高。液滴式相對芯片式成本有所下降，但典型的液滴式dPCR液滴形成和PCR擴增和檢測都分別在不同儀器中完成，增加了很多操作，也增加了系統的復雜性，從這點上看全自動熒光定量PCR做得更好。

小結

盡管dPCR被稱作第三代PCR技術，但dPCR技術的廣泛應用逐漸顯現出一些不足之處。通量不高、操作復雜，同時成本大大增加，dPCR似乎還沒有找到相對qPCR足夠的不可取代性優勢。另一方面，dPCR增加了很多技術難點，如何制作成本低廉的芯片，如何集成液滴生成和PCR擴增，如何進行靈敏的信號檢測和分析，如何提高自動化程度，實現Sample-In Result-Out。相較于Digital ELISA能夠提高免疫檢測的靈敏度到fg/mL級別，實現了高敏蛋白的檢測，dPCR盡管發展更早，卻難以取得Killer Application，或許這也導致了所謂的第三代PCR在很多人看來卻沒那么“下一代”。

附：PCR原理

PCR實際上是一個在模板DNA、引物(模板片段兩端的已知序列)和四種脫氧核苷酸等存在的情況下，DNA聚合酶依賴的酶促合成反應，擴增的特異性取決于引物與模板DNA的特異結合。