超高效液相色譜洗脫技術的質量取決于什么?如何利用QbD評判色譜儀洗脫質量，它除關注關鍵性的鄰近雙峰外也考慮了洗脫的穩定性。
圖1 色譜洗脫技術的經驗模型。模型中的影響因素有梯度時間(tG)、溫度(T)、有機洗脫劑B的初始濃度(%Bs)及最終濃度(%Be)、水質洗脫液A的酸堿度pH值以及流率(F)，還有目標值、多峰值的分辨率以及最短的分析時間等
液相色譜洗脫技術質量的好壞與許多因素及目標值相關。在醫藥產品的小分子檢測分析過程中，根據小分子的實際情況影響UHPLC超高效液相色譜分析質量的因素最多可達十項，而且它們之間的相互作用及相互影響十分明顯。這些因素都可以在梯度時間(tG)、溫度(T)、三元洗脫液組合物(tC)、有機洗脫劑(B)的初始濃度(%Bs)和最終濃度(%Be)、水質洗脫液A的酸堿度pH值以及流率(F)中被找到。當然，洗脫柱的固定相也是一項十分重要的影響因素。這里的目標值被視為是UHPLC超高效液相色譜洗脫過程優化時的關鍵分辨率Rskrist(色譜圖中最差的雙峰分辨率)以及檢測分析時間最小化時色譜圖中最后一個峰值的保留時間tRmax。常規的分析時間最小化方法具有明顯提高檢測分析流量及提高UHPLC超高效液相色譜分析實驗室生產能力的潛力。
市場中銷售的計算機輔助超高效液相色譜分析方法開發軟件(CMD)，例如，Dry lab(莫爾納—色譜應用技術研究所)及Chromsword(VWR國際公司)最多具有對三個因子進行優化、只允許有一個目標值(關鍵雙峰分辨率)的限制。繞過了其“全面優化”方法，沒有一項診斷分析或只允許有一個策略來識別及改善存在的問題。
當UHPLC超高效液相色譜洗脫篩選的工藝參數大于三個以及目標值大于一個時，則可以利用非常高效的計算機輔助超高效液相色譜洗脫優化軟件(色譜技術建模軟件，例如，Dry lab 4)和統計試驗設計(統計試驗設計軟件，例如，Modde 11 Pro)來實現。
試驗
試驗由Robert Kormany先生(Egis制藥公司)、Imre Molnar先生及H.-J. Rieger先生(Molnar研究所)負責完成，試驗參數為：
色譜柱：規格為50×2.1?mm的UHPLC色譜柱，填料粒度2微米。
洗脫液：流動相是乙腈及5?mm磷酸二氫銨—緩沖液混合而成的混合液。樣本中含有10μg/mL的氨氯地平及歐洲藥典中的污染物(A、B、D、E、F、G和H類)，溶液中乙腈及水的比例為30:70(容積比)。
九項不同的UHPLC色譜柱，每一項均做出四次色譜洗脫(線性梯度30%B～90%B不等，梯度時間3分鐘及9分鐘，溫度15攝氏度及45攝氏度)，含有磷酸鹽的緩沖劑A具有三項不同的酸堿度pH值(2.0/2.5/3.0)，試驗設備型號為Shinadazu LC 2010C(滯留容積1.06毫升)，探測波長為254納米，注射量為1μL。
建立在經驗基礎之上的過程模型
從(由Molnar色譜技術研究所提供)3因子優化原始數據可以推導及建立起UHPLC超高效液相色譜分析過程。同時，優化時所需的所有工藝參數均適用于3個色譜柱、具有六項參數及多目標的分析過程經驗模型(參見圖1)，并能使該模型可視化。為實現最穩健的篩選，該實驗應用高效的統計試驗設計方法。在統計試驗設計的基礎上建立起一項基于經驗的統計學保障過程模型，并在模型驗證中利用簡單的統計學(殘差分析)診斷對該模型進行篩選，在該步工作中經常發生目標沖突問題。將某項參數朝向有利于某一目標值方向調整時，往往會對另一目標值帶來不利影響。為了穩健的進行參數的篩查及甄別，必須利用一項多目標模型。該模型中涵蓋了所有參數從最小到最大的調整范圍，稱之為試驗區間;在QbD質量源于設計的原理之中，也同樣稱之為知識空間。一般情況下，它比隨后測定的設計空間大許多。大多數情況下，人們需要多項目標值，以便在一系列試驗中達到所有的試驗目的。雙峰的分辨率依舊是現如今UHPLC超高效液相色譜洗脫技術中的一項最重要目標值。
參數篩查的試驗計劃
試驗設計及QbD質量源于設計分析，是建立在含有所有參數及多目標的UHPLC洗脫模型基礎之上的最有效方法，最大的問題便是：UHPLC洗脫模型優化時經常因試驗條件的變化導致原來的雙峰順序發生逆轉。現就舊模型中將分辨率作為目標值的問題提出兩點異議：
第一點：A和B兩個峰值改變了它們的流出順序，一次是A先B后，另一次是B先A后。為了能夠區別此兩種情況需要在這兩項分辨率前標上負號(例如：RS(AB)=1.5及Rs(BA)=-1.5)。
第二點：因試驗條件的改變，試驗設計計劃中的實驗會得到不同的雙峰，這些雙峰均需要作為關鍵雙峰對待。第一項異議可歸咎于DoE實驗設計方法過程運用的笨拙化。若在峰值順序發生改變時簡單將其分辨率前加上負號則被稱為隱式應用，其“絕對值”為零，但并沒有使用絕對值函數，也沒有引用絕對值函數。相反，便是另一種分辨率，僅將“分辨率>極限分辨率”與“負分辨率<負的極限值”視為等價。從洗脫質量角度看，這兩點絕對等同。第二點不同意見恰恰是使用實驗設計最好的論據之一。利用同一模型得到的所有雙峰數據均是由同一實驗計劃得到的數據。在多目標值優化中使用帶有負號的分辨率是為了定義與轉換點具有足夠安全距離的設計區間。
圖2 設計空間超立方體中穩定固定相篩查時的tG-T數據圖
結果及討論
DoE實驗設計方法在目標值Rs及tRmax試驗中的結果請參見原始數據圖。尤其值得注意的是：1-2，5-6及6-7三個雙峰的分辨率。在這些雙峰數據中，由于所需試驗條件的變化，雙峰的順序也出現了逆變;也就是說：出現了帶負號的分辨率值。6-7號雙峰對應的是Triart色譜柱，5-6及6-7號兩組雙峰數據對應的是Kinetex XB C18色譜柱，而Acquity BEH C18色譜柱對應的是1-2，5-6及6-7等三個雙峰(附條)。除了洗脫順序外，關鍵雙峰也因試驗設計造成實驗因子設置的改變。
圖3 色譜洗脫的穩定性：穩定固定相篩查時的T-%Bs–tG-F 等參數的4D設計空間圖
穩健的優化
目前，在對UHPLC超高效液相色譜技術建模過程的最佳工作點計算時，找到最接近目標值的解決方案，需使用商業的計算機輔助軟件CMD[11，12，13]，而找到穩定的(全局的)工作點(參見表1)則允許在保證遵守UHPLC超高效液相色譜洗脫技術規范的前提下在設計空間中使用最大的因子變量。除此之外，也測定了適用于各種色譜柱類型的UHPLC超高效液相色譜洗脫穩定性(參見圖2)。對三種UHPLC色譜柱均進行了類似的穩定工作點計算，同樣遵守了所有色譜柱目標值區間(-1.5≥-Rs.krit或Rs.krit≥1.5)的規定。
若只考慮色譜柱最后的峰值，關鍵雙峰Rs.krit和tRmax的分辨率質量時，則Kinetex XB C18色譜柱是常規分析時最合適的洗脫色譜柱(具有足夠的關鍵雙峰分辨率，極短的分析時間)。
高效液相色譜分析的穩健性
25年前就有人提出：除關鍵雙峰的分辨率之外UHPLC洗脫的質量評判標準還應包括洗脫的穩定性，而在UHPLC洗脫穩定性判定過程中，QbD質量源于設計的核心就是對于設計空間大小的估計。利用設計空間超立方體，一種在不規則設計空間中具有最大可能規則形的超方形(虛線覆蓋的面積)則會在設計空間中的一小塊二維區間tG-T(對HPLC高效液相色譜洗脫具有最強影響)內將多因素、多目標優化的穩定結果可視化(參見圖2)。
正如從圖片中推斷出來的那樣：Triart C18色譜柱在UHPLC洗脫中具有最大的設計空間超立方體面積，也就是說：在Triart C18色譜柱中進行UHPLC洗脫最穩定。在Acquity BHT C18色譜柱中，UHPLC洗脫的設計空間超立方體面積最小，表示它的洗脫穩定性最差。該事實也在4D設計空間圖(參見圖3)中呈現出來，圖中綠色面積的大小表示T、%Bs、tG及F等最重要因素的穩定性，同樣確定了根據設計空間超立方體導出的各因子公差極限(參見表2)。
從圖3中仍可推斷出：Triart C18色譜柱在設計空間區域中同樣具有較大的綠色區域(誤差概率為1%);也就是說：色譜洗脫最穩定。在UPHLC超高效液相色譜洗脫中，Kinetex XB C18色譜柱的洗脫穩定性并不好。最不穩定的UHPLC洗脫出現在Acquity BHE C18色譜柱中(沒有綠色)。利用設計空間超立方體的最高極限值及最低極限值可確定UHPLC超高效液相色譜洗脫中各個因子可能的公差帶(參見表2)。
在利用Triart C18色譜柱的UHPLC超高效液相色譜洗脫時，可以得到最寬的因子公差帶;也就是說：每種因子均具有最大可能的變動范圍(保證目標值前提下在設計空間范圍內參數設置的變化)。在誤差概率設定為1%的公差范圍內，參數的調整設置(PAR)不得影響UHPLC超高效液相色譜洗脫質量(-1.5≥-Rs.krit或者Rs.krit≥1.5)。
圖4 表示最穩定工作點以及設計空間超立方體最高、最低點的6因素DoE統計實驗方法模型的Dry lab 4.0模擬色譜圖
對于UHPLC洗脫的控制
在穩定工作點以及在設計空間超立方體最高與最低頂點的色譜圖表明了UHPLC色譜洗脫質量。在設計空間超立方體中所有的三點中，目標特征值(-1.5≥-Rs.krit或者Rs.krit≥1.5)均得以保障。
如果在評判UHPLC色譜柱的質量時只考慮色譜柱最后峰值關鍵雙峰Rs.krit和tRmax的分辨率時，則Acquuity BEH C18色譜柱是常規分析時最合適的洗脫色譜柱了(關鍵：雙峰最佳的分辨率，短暫的分析時間)。若在評判洗脫質量時仍需要考慮UHPLC超高效液相色譜洗脫的穩定性，則Acquuity BEH C18色譜柱便是最不適合的色譜柱、Triart C18便是常規分析時最適合的色譜柱!
只有同時考慮所有的重要因素以及選擇另一分辨率(例如，關鍵雙峰的分辨率Rs.krit)作為目標值并在考慮了色譜洗脫的穩定性之后才能得到有說服力的UHPLC洗脫質量，并能夠有目的的選擇出最合適的UHPLC色譜洗脫柱，高效、穩定的在保證遵守目標特征值(-1.5≥-Rs.krit或者Rs.krit≥1.5)的前提下完成色譜洗脫。
小結：本文介紹的是一種評判UHPLC超高效液相色譜洗脫質量好壞的系統方法。除關鍵雙峰的分辨率之外，也將洗脫穩定性納入評判色譜洗脫質量標準之中。只有通過設定穩定的工作點、可靠的因子公差范圍PAR及關鍵雙峰的分辨率，才能描繪出UHPLC超高效液相色譜洗脫技術的特征。只要參數、因子都在設定的范圍內變化，就無需對UHPLC色譜洗脫重新進行驗證。
本文作者Hans-Werner Bike先生系Brannenburg市，LC-Pharm公司HPLC高效液相色譜技術服務專家;Andreas Orth先生是法蘭克福市，法蘭克福大學應用科學系教授。