六孔板培養基在植物提取物細胞研究應用

　　來自巴西等國的科研人員在2019年第13期的《DRUG DISCOVERY》雜志上發表了題為“In vitro and In vivo Antiproliferative activity of extracts and fractions of leaves and stem from Tabebuia hypoleuca (C. Wright) Urb.”的文章。文中，科研人員使用中空纖維測試法（Hollow Fiber Assay，HFA）作為實驗動物體內模型，以研究植物提取物的體內抗腫瘤細胞增殖活性。以下為原文內容簡介，詳細內容，請參考原文。

　　摘要：背景：Tabebuia hypoleuca （C.Wright）Urb. 是一種古巴特有的植物，之前沒有被作為抗腫瘤藥物進行研究，但該屬植物被報導具有多種藥理活性。目的：該項研究的目的是研究Tabebuia hypoleuca （C.Wright）Urb.提取物及其葉、莖部分的體外和體內抗增殖活性，并研究其莖的主要部分（TT2）的化學成分。方法：體外抗增殖活性在8種人腫瘤細胞系內進行。選擇總生長抑制（TGI）值測量抗增殖活性。體內實驗在載Ehrlich實體瘤的Swiss小鼠和載MCF7細胞的中空纖維測試法內進行。實驗使用葉的乙酸乙酯粗提物（THA）、半純化合物（TH 3-6和TT2-11）和陽性對照。結果：在所有評估的細胞系中，THA、THA（3-6）、TT2證實對腎、膠質瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、結腸癌和白血病細胞系具有較高的體外抗增殖活性。相對對照組（生理鹽水），THA、THA3-6腹腔給藥可顯著抑制腫瘤發展。結論：本研究表明，在T.hypileuca中存在不同的五環三萜類化合物，具有良好的抗腫瘤活性。進一步的研究將聚焦于確定這些化合物作用機制和毒性。

　　使用MCF-7（乳腺癌）進行的中空纖維測試法

　　研究在免疫完整的BALB/c小鼠內進行了MCF-7人腫瘤細胞系實驗。細胞以正常條件培養，然后以標準的胰酶消解方法收獲細胞，重懸至所需的細胞密度（1 x 10^5 cells/fiber，160μl培養基）。細胞懸液注射進中空纖維，然后熱密封，剪成2cm的小段。纖維在含有培養基的六孔板內孵育24h，然后手術植入免疫完整的6-8周齡BALB/c母鼠體內。將含有MCF-7的三根纖維皮下植入小鼠側腹。小鼠按30mg/kg 戊巴比妥鈉（第0天）麻醉，切口縫合。同時制備體外對照纖維，實驗過程中，在培養基內孵育（7天），作為動物植入時評估纖維內細胞數量的對照。細胞生長用MTT方法評估。

　　處理組每日給藥THA、THA3-6、TT2，陰性對照組給藥0.9%生理鹽水+80%吐溫，陽性對照組給藥3mg/kg 阿霉素。第7天，小鼠安樂死，回收纖維。去除纖維上的宿主組織，將纖維轉移至含有RPMI+FBS培養基的6孔板，加入MTT溶液，37℃避光孵育4h。吸取培養基，纖維保持在2.5%魚精蛋白溶液中，于4℃孵育24h。纖維對半剪開，加入染色液，避光孵育4h。吸取150μL加入96孔板，分光光度計讀數分析。

　　結果：在第7天回收纖維，定量檢測細胞增殖。在150mg/kg/day的劑量條件下，葉的乙酸乙酯粗提取物可降低腫瘤細胞MCF-7的細胞增殖（59.1%），半純化合物THA（3-6）處理降低43%，阿霉素可降低（60.6%），TT2（11）處理對該細胞增殖無影響。

　　動物可良好耐受中空纖維，未檢測到排斥信號。以從T.hypoleuca獲得的粗提取物和半純化合物以及阿霉素處理不會超出接受限地影響小鼠狀態，沒有觀察到死亡。粗提物或半純化合物處理組沒有觀察到體重變化。此外，為評估與藥物處理相關的毒性作用，對處理組的肝臟、腎臟、心臟、肺和脾進行了組織學分析，但結果顯示粗提取物和半純化合物對分析器官的形態無影響。

　　中空纖維測試法是一種標準的體內模型，可同時評估多種細胞系，其是由美國NHI開發的體內藥物活性評估模型，相比移植瘤模型，可降低評估的時間，節省所需的化合物用量。

　　原文：L.M.S.Perera, A.I.R.Veloz, A.L.T.GoisRuiz, et al., In vitro and In vivo Antiproliferative activity of extracts and fractions of leaves and stem from Tabebuia hypoleuca (C. Wright) Urb..Drug Discovery, 2019, 13: 10-21.