二維色譜使樣品組分在兩個不同的分離條件下進行分離，可顯著提高分離能力，降低色譜峰重疊，同時改善色譜峰鑒定的可靠性。在不同的二維色譜技術當中，在線全二維液相色譜技術由于其在較短時間內可以獲得高峰容量、樣品損失低、重現性好及自動化程度高，成為對于復雜體系分離時最受關注，發展最迅速的技術。本文著重介紹了在線全二維色譜技術的概念、特點和分離優勢，及其在中藥復雜體系質量控制分析中的應用。
近年來通過提升色譜柱效，進而提升分離能力的技術得到蓬勃發展。以亞二微米填料技術為基礎的超高效液相色譜技術，及高溫多柱串聯技術皆使液相色譜的分離度提升到更高的水平。超臨界液相色譜技術的復興與質譜技術的發展，則是從選擇性的層面為分離度的改善提供了另一實用的技術或工具。其中質譜的選擇性離子監測技術大大拓展了分離緯度。但離子抑制現象的存在影響了對不同濃度物質檢測結果的靈敏度和準確性，尤其對于低濃度組分而言，與采用5μm經典色譜柱的高效液相色譜相比，上述采用單一液相色譜模式（1D-LC）進行的分離，雖提升了分離能力，但時間較長，若要實現一維（1D）液相色譜的最高峰容量（1400~1600之間），分離時間需長達幾個小時。復雜混合物的分離需要更高的分離能力，通常需要梯度色譜實現分離，其分離能力最好使用色譜峰容量來衡量。簡單而言，峰容量是衡量指定時間內，使用指定色譜柱，能以一定的分離度分開均勻分布的色譜峰個數。峰容量數值越大，分離能力越強，可分開更多的色譜峰。根據理論計算，峰容量數值要約大于色譜峰數量100倍，才可能基本分離在色譜圖上隨機分布的色譜峰。1D-LC在適當分離時間內，有限的分離能力及對復雜體系分離分析的需求，使二維液相色譜技術應運而生，近年來日益受到關注。
2D-LC技術的特色及優勢
2D-LC技術是樣品經過兩個不同分離機理或過程的液相色譜分離，通常通過柱切換技術來完成，其最大優勢是能提高峰容量。理論上2D-LC的峰容量是1D與二維（2D）色譜分離峰容量的乘積，遠高于1D-LC獲得的峰容量。實際分離過程中峰容量的結果會受限于2D-LC的正交性程度及分離過程中兩維分離的實際效率。但優化的2D-LC方法通過兩個不同分離過程或機理對相同樣品的分離，可降低色譜峰的重疊，顯著改善分離結果。此外，由于一個組分可獲得兩個保留時間（1D和2D），可增加色譜峰確認的可靠性。
2D-LC可分成離線與在線兩種類型。離線2D-LC是將一維色譜柱分離出的餾分，按時間依次收集后濃縮，或直接進樣，進行2D分離。與在線2D-LC相比，操作上較簡單，峰容量較高，可免除1D與2D的色譜兼容性問題；但離線模式分析時間長，難于自動化，重現性較差，若樣品組分不穩定，會在2D-LC分離前發生變化。在線2D-LC不僅能在短時間內獲得高峰容量，且自動化程度高，是目前復雜體系分離手段中發展最快和最受關注的技術。
在線2D-LC又分為中心切割和全二維兩種方式，1D與2D兩只色譜柱通過閥或接口相連。二者的區別在于1D色譜柱出來的組分轉移到2D色譜柱的量。對中心切割方式而言，從1D洗脫出來的餾分，只有含有目標餾分或組分的部分被轉移到2D色譜柱上繼續進行分離。常見的在線固相提取也可為2D-LC中心切割的一種方式。該分離方式的主要特點是：第一個色譜柱中洗脫出來的組分僅部分進入第二維色譜柱；通常色譜峰會被整個切出，第二維采用較長的色譜柱，故梯度可比全二維長；損失部分樣品信息，但目標色譜峰的數據質量更好。
在線2D-LC進樣方式中所有從1D色譜柱流出的組分都被轉移進入2D色譜柱進行分離。兩個色譜柱通過接口相連，確保將第一維色譜柱流出的所有組分自動切入第二維色譜柱中進行分離。在后續餾分被切入第二維色譜柱之前，前一個餾分已成在二維色譜柱上分離。第二維的分析時間應該是少于或等于閥的切換周期。通常1D色譜柱30min的一次進樣分離，可有近百個來自1D色譜柱的餾分切入2D色譜柱，相當于對2D色譜柱的近百次進樣與分離。在線2D-LC分析的運行時間即是1D分離的時間，可在較短時間內實現較高峰容量。在線2D-LC過程的主要特點是：1D色譜柱中洗脫出來的組分全部依次進入2D色譜柱；1D色譜柱一個色譜峰通常會被切成3~4個餾分，分別進入超快梯度分離的2D色譜柱中進行分離；分離過程中保持1D色譜柱所獲得的分離度；第二維色譜方法的運行時間與第一維洗脫餾分的收集時間需匹配；色譜峰在數據分析時需軟件重新構建。
典型的全2D-LC系統組成包括：2個色譜泵、2個色譜柱、1個進樣器、1個接口或調制器（包括閥、定量環或富集色譜柱），以及一個檢測器。工作站軟件的設計對全二維2D-LC系統也非常重要，因為通常一次1D進樣，甚至需要上百次的2D梯度分離，若手動設置這些梯度表，不僅耗時，且容易出錯。新型商品化2D軟件的發展，不僅可以簡化和縮短實驗設置過程，而且可以簡單根據1D分離梯度變化靈活設置2D分離的不同梯度，以實現更好的分離效果元。全2D-LC的3D數據分析需要專門的軟件進行定性與定量。
在線全2D-LC的分離質量與方法的設計、液相色譜系統的硬件優化以及數據系統的控制與數據分析能力直接相關。按照2D-LC方法設計，兩維分離模式組合的選擇對方法的正交性影響最大，會直接影響到峰容量的大小。因此，兩維色譜柱的選擇不僅要考慮到填料分離模式的選擇性差異。此外，還需要關注兩維分離中所用溶劑的兼容性和具體的操作條件優化。RP（反相色譜）、NP（正相色譜）、SCX（陽離子交換色譜）、SEC（體積排阻色譜）及HILIC（親水相互作用色譜）皆可用于2D-LC的兩維色譜組合，其中SCX-RP、HILIC-RP以及RP-RP/2D-LC的正交性最為理想。上述組合在蛋白組學、食品分析、植物提取物分析、生物制藥分析及聚合物等復雜體系分析中皆有應用元。2D分離甚至可使用平行的多個色譜柱以進一步提高峰容量。
1D和2D色譜柱之間的接口設計也至關重要，是全二維2D-LC硬件技術的核心。良好的接口設計可以確保完全對稱的流路，盡可能降低或避免兩維溶劑的相互影響，降低分離過程中的色譜峰擴散。接口的突破性技術會大大提升全2D-LC的方便性與實用性，使得這項技術更加簡單易用。此外，2D-LC系統的硬件優化需考慮對小規格色譜柱的兼容性，2D的快速梯度分離能力，以及色譜檢測器的高靈敏度檢測能力。
在線2D-LC在中藥質控的應用
在線全2D-LC可在短時間內實現高峰容量，適于復雜的中藥體系分離，成為中藥質量控制的有力工具。中心切割法可在線有效地去除干擾組分，適用于中藥復雜體系目標組分的定量分析。使用在線SPE-HPLC法分析復方甘草制劑中的嗎啡是中心切割法2D-LC在中藥質量控制方法中的應用實例。該方法在1D與2D色譜柱間使用了富集小柱，通過軟件自動控制閥切換，實現了樣品凈化、富集與分析的全自動過程，以高重現性實現目標組分嗎啡的定量分析。與離線SPE過程相比，方法分析速度快，分離效果良好，操作簡便，使用成本低。
根據中藥復雜物質組成的特性，使得2D-LC，尤其是在線2D-LC技術有更加廣泛的發展空間。一方面該技術較強的分離能力可用于建立不同品種和相同化學組分定量分析的質量控制通用方法的技術平臺，同時實現中藥品種目標化學成分定量與指紋圖定性；另一方面可在提高中藥質量標準中發揮其信息豐富，分離能力強等技術優勢。2D-LC與質譜聯用時，單一色譜峰可獲得豐富的數據信息、如色譜峰的1D和2D保留時間信息，色譜峰光譜信息和質譜信息。這些信息大大增加數據的置信度，提高中藥組分定量與定性的可靠性。此外，2D-LC的多維信息具有更強的指紋特性，可用于中藥組分的質控與溯源分析。
圖4是某中藥注射液的在線全2D-LC分析元，可看出在第一維保留時間（橫坐標）相同的色譜峰可以在第二維（縱坐標）上完全分離。該方法還使用飛行時間質譜檢測器（TOF）與全2D-LC系統相連，因此直接獲得了相應組分的準確分子量信息，并利用譜庫直接檢索，推斷和確認了色譜峰的化學結構。在線2D-LC可去除1D分離中非揮發性的，質譜不兼容的緩沖鹽流動相，在不改變原始色譜條件下，即保持1D分離選擇性的前提下，選擇性地中心切割目標組分進行質譜分析元。
小結
在線2D-LC技術能在適當的分析時間內大幅提高色譜峰容量和分離能力，在中藥復雜體系質控中的應用前景廣闊，其中心切割模式能有效去除復雜體系的干擾物質，是簡化樣品前處理，實現復雜中藥體系自動化和高通量定量分析的有效途徑。整合2D-LC硬件和軟件的商品化全2D-LC系統的出現，為高通量自動化分析創造了有利條件。