硝基呋喃的殘留驗證

利用改進了的蒸發方法驗證硝基呋喃的殘留

硝基呋喃類抗生素具有潛在的致癌作用，因此歐盟規定，在食品生產過程中需對硝基呋喃進行嚴格的檢驗控制。而合適的樣本制備方法則能幫助提高檢測分析的效率和準確度。

由于硝基呋喃殘留物可能有致癌作用，從1995年起歐盟開始命令禁止使用硝基呋喃類抗生素。2002~2003年歐盟建立了嚴格的監控管理制度，通過高靈敏度的檢測方法對食品(主要是肉、魚、貝類)中的抗生素類進行嚴格檢驗。歐盟規定最低執法限量為可食組織1μg/kg,這一執法限量不僅適用于歐盟本地生產的食物也同樣適用于進口食物。

關于這類藥品代謝物和衍生物的檢測、識別方法有很多。但為避免基質效應，對樣本制備的方法要求比較高，制備過程中的蒸發是一件費時費力、工作密集型的工作。本文將向您介紹：蘇黎世Kantonalen實驗室(KLZH)所研發的優化樣本制備的方法。

圖1：硝基呋喃樣本的制備和分析方法。

硝基呋喃檢驗分析樣本的制備

許多文獻所介紹的樣本制備方法是基于色譜分離技術或質譜分離技術(MS)的物理-化學分析的樣本制備方法。而蘇黎世Kantonalen實驗室的常規方法(見圖1)如下：

組織樣本的均質化;酸水解，釋放組織結合的代謝物;在代謝物的衍生物中加入鄰硝基苯甲醛，提高分子量和檢測靈敏度;利用乙酸乙酯進行液-液萃取;蒸發至干燥;用水再懸浮;清潔樣本，利用固相萃取(SPE)清除干擾性的矩陣元素，例如去脂;利用含氨的甲醇進行洗提;蒸發至干燥;用規定的、適合于色譜分析的較低溶劑量進行再懸浮;利用超高效液相色譜(UHPLC)和MS / MS進行分離。

樣本制備過程中，萃取和兩次蒸發干燥過程是非常耗時的勞動密集型的工作。

在蘇黎世Kantonalen實驗室中，蒸發是利用傳統的旋轉式蒸發器進行的;在硝基呋喃檢測中，這種制備方法被證明是有著高提取率的可靠方法，但此法被證明也有一些不足。

由于旋轉式蒸發器是一種‘單一的’的樣本制備設備，這就需要對蒸發過程進行不間斷的監控，避免出現“泡沫”或“沸騰延遲”等現象。

在蘇黎世的實驗室中，硝基呋喃的一個檢驗批次的樣本通常是5~30個。當制備樣本的數量較少時，可以用旋轉式蒸發器來完成樣本制備。

蒸發技術的革命

為提高蒸發效率，開發了以下三種原則上屬于‘批處理’的蒸發方法：

圖2：吹氣蒸發(A)、渦流蒸發(B)和真空離心蒸發(C)三種蒸發方法原則上都適合于大批量的樣本制備。

吹氣蒸發

這種方法是利用針頭般的細管把氣體(如氮氣)吹入樣本容器中，在液體樣本表面產生一定的氣體流動，改變氣相與液相之間的平衡。樣本的溫度隨著加熱的溫度升高而升高，利用加熱來提高蒸發效率。

但對于易揮發的液體介質來說，這種蒸發方式樣本提取率不高，但冷吹蒸發是一種相對較快的蒸發方法。針對沸點高的液體或像水一樣不易蒸發的液體，冷吹蒸發的過程會明顯變長。同時，也要求操作者要時刻監視蒸發過程，判斷是否到干燥結束的時候了，或觀察針頭細管距液體表面的距離是否最佳。

渦流蒸發

在這一蒸發方案中，樣本將在真空環境中被加熱，保證了樣本在蒸發過程中是‘冷的’;并且對樣本施加一定的振動力，以便液體樣本內出現渦流。渦流使得液體介質的表面積增大，從而加速液體蒸發。但這也把干燥的物質分布到較大的面積上，粘附在容器壁上，增加了收集的難度。由于要避免沸點延遲和發泡的渦流運動，導致和離心蒸發不同的是，其所需的重力加速度g并不高，系統的控制裝置能夠在蒸發過程中自動調整渦流運動所需的能量。但渦流蒸發通常會造成樣本污染和或損失。

真空離心蒸發

真空離心蒸發是在真空狀態下使液體中的水分被蒸發，因此樣本保持著‘冷態’。這一系統是使用冷阱來回收溶劑蒸氣的。在離心力的作用下，液體表面下凹。這種蒸發有效的避免了煮沸溢出、起泡沫和沸騰延遲等現象，也避免了樣本的損耗或交叉污染。

溶劑施加在液體表面的壓力與環境系統保持一致，壓力是由該材料的質量乘以轉子產生的g力而形成的。離心蒸發技術適用于蒸發多種不同液體樣本時使用。樣本可以在真空離心蒸發過程中被濃縮，直至干燥成膜;或被凍干。控制系統可以自動化完成蒸發過程，而且系統有干燥終點識別功能。

蒸發系統的評判結果

以硝基呋喃的分析為例子，對上述三種蒸發系統在樣本制備中的性能進行了分析評判。主要從樣本污染、蒸發時間長短和沸點延遲、溶劑回收和使用的必要性、經常性等方面進行評判。評判的結果見表1。

表1：溶劑蒸發設備的評判分析結果

降低了交叉污染的風險，節約了時間

在處理一批次20件樣本時，利用旋轉式蒸發器第一次蒸發干燥需要大約1.5h，第二次還需2.5h~3h。在完成20個樣本制備時，總共需要大約4h~4.5h的操作和監控時間，其中也包括了更換樣本的時間。

在利用真空離心蒸發時，樣本制備的兩次蒸發干燥用時共計3h。而且在這一段時間內真空離心蒸發設備是自動運行的，無需專人監控，操作者可以在此期間去做其他未完成的工作。

此系統一次可以制備48份硝基呋喃測試樣本。雖然樣本數量較多，但制備時間只比20份樣本所用時間多出1h。與旋轉式蒸發器相比較可以縮短大約2h~3h的時間。

在蘇黎世KLHZ實驗室安裝使用了EZ-2 Envi型(英國Genevac公司)蒸發器后可以比原來在硝基呋喃樣本制備過程中節約2小時到3小時的時間。這一設備允許在一個工作日內處理大量的檢測樣本。它降低了交叉污染的風險。過去經常出現的假陽性診斷分析結果是一個樣本或者整批樣本重新分析(多重分析)主要原因。但現在EZ-2 Envi的全自動控制就完全避免了這種可能性。

圖3.Ex-2 Envi 蒸發器。

提高樣本制備的能力

在食品的硝基呋喃樣本制備過程中，要提取樣本并進行兩次蒸發干燥。這一過程是一個耗費時間和勞動密集型的工作過程。真空離心蒸發技術能夠幫助您節約大量的時間。它不僅能夠處理大量的樣本，同時也降低了交叉污染的風險。另外，這一檢測分析設備還是一種全自動的、可以無人值守的檢測分析設備。