現代UHPLC系統用于做簡單的分離時，完全可以使用1 mm內徑的色譜柱。那么其分離效果如何?怎樣才能做到節約溶劑呢?本文會告訴你答案。
液相色譜技術的最大的創新源于2004年引進的超高效液相色譜(UHPLC)技術，首次實現了利用高壓及小顆粒柱材料進行色譜分離，使得快速，高效和靈敏的分離得以成為現實。對體系所有相關容積的最小量化，使得UHPLC成為內徑2.1mm和亞微米顆粒材料分離柱的理想系統。
此外，為減小在分離柱以外產生的峰展寬，近十年來，設備制造商一直致力于開發完善的UHPLC系統。其中包括對檢測池的優化和對內徑≤100μm的不銹鋼毛細管的研發。在使用溶劑梯度進行簡單分離時可以使用1mm內徑的色譜柱進行操作，可節省溶劑和改進質譜的兼容性。
圖1.如何在現代的UHPLC系統中(圖中為Shimadzu的Nexera X2)節省溶劑。
實驗部分
液相色譜為島津公司的Nexera UHPLC系統。其模塊化系統包括兩個LC-30 AD泵，一個SIL-30 AC自動進樣器，一個CTO- 30 AC柱恒溫爐，一個SPD- M30A二極管陣列檢測器和一個CBM- 20A系統控制器。系統控制和數據處理使用的是LabSolutions軟件版本5.57 。實驗中采用了兩根不同內徑的安捷倫ZORBAX StableBond C18分離柱( 2.1 × 50mm，1.8μm和50 ×1mm，1.8μm)(由安捷倫科技公司的Bernd-Walter Hoffmann博士和Edgar N?gele博士友情提供)。試驗混合物使用的是Sigma-Aldrich公司經過認證的標準樣品( 47651 -U )，它由13種醛和酮-2,4 - 二硝基苯腙組成( 2,4 - DNPH)。該混合物的各成分列在表1中。
表1.測試混合物和它們的洗脫的組分的概述
|
分析 |
洗脫 |
|
甲醛-2,4 - 二硝基苯肼 |
1 |
|
乙醛-2 ,4-二硝基苯肼 |
2 |
|
丙烯醛-2,4 - 二硝基苯肼 |
3 |
|
丙酮-2,4 - 二硝基苯肼 |
4 |
|
丙醛-2,4 - 二硝基苯肼 |
5 |
|
巴豆醛-2,4 - 二硝基苯肼 |
6 |
|
甲基丙烯醛-2,4 - 二硝基苯肼 |
7 |
|
2 - 丁酮 |
8 |
|
丁醛-2,4 - 二硝基苯肼 |
9 |
|
苯甲醛-2,4 - 二硝基苯肼 |
10 |
|
戊醛-2,4 - 二硝基苯肼 |
11 |
|
M-甲基苯甲醛-2,4 - 二硝基苯肼 |
12 |
|
六角醛-2,4 - 二硝基苯肼 |
13 |
標準樣品在注射前用水/丙酮60 /40(v/v)的混合溶劑稀釋了10倍。方法開發使用的是Drylab軟件(Molnár 應用色譜研究所)并考慮了有機溶劑在流動相中的含量和溫度的因素。
結果和討論
圖2 .分離13種醛和酮-2,4 - 二硝基苯腙。
實驗第一步是在一根2.1mm內徑的分離柱上，借助Drylab軟件開發醛和酮-2，4-二硝基苯腙的分離方法(圖2a)。標有星號的峰源于標準中的雜質，故在方法中不予考慮。分析物在3.5min內得以分離，其7/8號峰之間的臨界分辨率為1.41。由于使用了1.2ml/min的高流速和1.8μm顆粒填充的柱子在進行溶劑梯度時最大壓力達到1080Pa。為將圖2a中所示的方法無損失地移置到一根1mm內徑的分離柱上，就必須進一步減小UHPLC的系統體積。為此，Shimadzu
SIL-
30自動進樣器的配置由直接注射改為了“固定樣品環”注射。這是就可減少樣品帶流過的通道及梯度滯后體積。基于研究中使用的分離柱僅區別于內徑，移置分離方法就只要求將流速由1.2ml/min降到0.272ml/min
。梯度分布不變。方法移置到1mm內徑分離柱上所得的第一批結果見圖2b所示。分離在預期的3.5min之內完成且實行溶劑梯度的最大壓力為825Pa。分離性能的損失顯而易見的，這在雜質引起的帶星號的峰上可以看得出來。當使用2.1mm內徑柱時(圖2a)，雜質與主成分可被分開。相比之下它們在1mm內徑柱上僅呈現為峰肩(圖2b
)。分離效率的降低也通過比較臨界分辨率體現出來。7/8號峰之間的臨界分辨率從2.1mm內徑柱時的1.41減小至1
mm內徑柱時的1.01。可以推測，峰形增寬是由于分離柱擴散體積的增大造成的
提高分離效率
大體積高靈敏度的二極管陣列檢測器的檢測池(池體積9μl)，將會在接下來的步驟中被1μl的檢測池所取代，并重復測量過程。得到的色譜圖顯示在圖2c。通過分離柱后擴散體積的減少來改善分離性能。分析物從分離柱上洗脫為窄峰，從而增加了臨界分辨率。7/8號峰的臨界分辨率由1.01增至 1.43。另外，標有星號的標準污染物再次從主組分中被分離開來。不過，降低檢測池的體積會導致檢測靈敏度的降低。使用1μl的檢測池相比于9μl的檢測池，其分析物的測定峰面積約減小9 ~10倍。
然而，采用1mm的色譜柱的UHPLC在溶劑消耗上很有優勢。表2是1000次分析所消耗的有機溶劑量與柱內徑之間關系的比較數據，結論是：使用1mm內徑柱注射1000次 樣品所用的溶劑和廢液處理費用可以減少4.5倍左右。
表2.溶劑成本的比較
|
方法 |
消耗丙酮 （ml） |
丙酮價格/L （歐元） |
1000此樣品分析的丙酮成本（歐元） |
|
2.1mm內徑色譜柱 |
2.33 |
39,70 |
92.50 |
|
1.0mm內徑色譜柱 |
0.51 |
20.25 |
優化的質譜聯用
使用1mm內徑色譜柱的另一個優點體現在與電噴霧電離質譜的偶聯上(ESI-MS)。為了達到最佳電離，在LC / ESI-MS系統中流動相的流速通常采用250μl/min或500μl/min。如果使用2.1mm內徑柱，流速會高出3~5倍(參見圖2a)，從而影響檢測限和定量限。相比之下，使用1mm的色譜柱時流速處于LC / ESI-MS偶聯的最佳范圍。
色塊
帶1mm色譜柱的 UHPLC
現代UHPLC系統用于簡單的分離和溶劑梯度時，使用1 mm內徑色譜柱，可以顯著節省溶劑和降低廢液處理成本。此外，使用1mm的色譜柱的流速最適合于電噴霧電離質譜的耦合。本研究中對系統柱前、柱后分散體積的最小化問題也已進行過優化。