控制基因敲除法

【探針技術用于檢測由siRNA介導的基因調制】

為了研究基因功能，科學家們常常會有針對性地關斷某些特定的基因。 而要驗證這種基因沉默的有效性, 就需要運用適當的具特異性的檢測方法。理想的檢測方法不僅要測量準確, 而且還要能讓細胞保持完好無損。

利用諸如RNA(核糖核酸)技術來調節基因表達已成為研究基因功能和生物反應機理的一種基本手段。常規的測定基因沉默率(基因敲除)的方法，需要采用細胞裂解或細胞壁通透以及細胞固定的方法將細胞加以破壞。而且這些技術的缺點還在于所測定的結果只能反映細胞群體的平均的基因表達。

轉染報告構建是一種對細胞無損害的檢測方法。然而這種方法雖能讓細胞保持活性, 卻不能對內源基因的表達進行檢驗。此外, 該方法對細胞的活性也有負面影響。理想的、非破壞性的RNA檢測試劑不僅要適合基因表達的研究, 還應能夠用于后續離析得到的活細胞的分選及分析中。

Smartflare“靈光”RNA檢測探針(EMD 密理博公司, 比爾里卡/美國)能夠檢測在活細胞中的目標RNA和微RNA水平。該探針不需載體就可進入細胞中, 且對細胞的活性無影響。此技術使得快速驗證基因表達成為可能。而且可結合應用細胞類型的分選手段, 可分選出所需的細胞群。此外, 探針試劑不需要樣品制備, 細胞經過檢測過程后不被破壞, 可在后續分析中繼續使用。

事實證明, 應用針對選定的目標RNA有特異性的探針，實現了準確有效地檢測siRNA介導的基因敲除。這種獨創的檢測單個細胞的RNA水平的探針技術，為實現生物路徑或生理過程與基因功能這兩個研究領域之間的聯系提供了新的可能性。

基因敲除和檢測：材料和方法

本文中所涉及的基因敲除, 流式細胞儀的mRNA(信使核糖核酸)測定和qRT-PCR(實時定量聚合酶鏈式反應)作為對比檢測的操作過程如下進行：

? 基因敲除：將SCC12細胞(人體鱗狀細胞癌)和LNCaP細胞(人類前列腺癌)接種于96孔微量滴定板上(10000個細胞/孔)。放置24小時后, 用對照siRNA及對生存素有特異性的siRNA來進行細胞轉染并孵育48小時。存活素是一種細胞凋亡抑制劑蛋白, 在許多癌細胞系中有明顯的升高。 孵育完成后, 更新培養基以去除siRNA和轉染試劑。

? 調制檢測：經過siRNA處理后的SCC12和LNCaP細胞，加上對生存素具特異性的Smartflare“星光”探針或Smartflare“星光”對照探針的1000倍稀釋液，一并在細胞培養基里孵育過夜。于次日將細胞用胰蛋白酶處理, 并用流式細胞儀(Guava EasyCyte 8HT)對其進行分析。同時, 將那些不作為采用Smartflare“星光”探針進行進一步研究的、業已經過siRNA處理過的細胞收集起來，用于進行實時定量逆轉錄聚合酶鏈式反應 (qRT-PCR)，作為對比定量分析之用。

? qRT-PCR：RNA總量用RNeasy試劑包(Qiagen公司)進行萃取, 然后加入到Taqman RNA-to-Ct1-Step Kit 試劑包(LifeTechnologies)的溶液中。實時定量聚合酶鏈式反應采用LightCycler 480系統 (Roche公司)進行。

mRNA的檢測分析結果

本研究中獲得了如下的分析結果：

?流式細胞儀測定mRNA： 為檢測基因敲除,將存活素特異性Smartflare“星光”探針和對照探針與用存活素和對照siRNA處理過的SCC12和LNCaP細胞一起孵育。特異性探針處理過的不同細胞的目標基因，其表達水平的差異通過流式細胞儀分析測定(見圖2)。

圖2.通過測定在LNCaP和SCC12細胞中存活素基因敲除的相對Smartflare“星光”信號，可以顯示其間的區別。直方圖中的 Smartflare“星光”信號，分別對應于具有或沒有進行存活素的siRNA敲除情況下，存活素在LNCaP細胞中(A)和SCC12細胞(B)中的 表達。

? 借助于qRT-PCR進行mRNA的檢測：為了利用qRT-PCR進行基因敲除的檢測, 將存活素特異性Smartflare“星光”探針和控制探針，與事先通過存活素和控制siRNA處理過的SCC12細胞和LNCaP細胞一起進行孵育。由Smartflare“星光”探針技術所測得的相對基因表達水平 采用柱狀圖表示，并與由qRT-PCR所得到的數據進行比較表明, 這種相對的基因表達水平在量化方面是相似的，而與敲除技術的測量無關(見圖3)。

圖3.在LNCaP和SCC12細胞內通過RNAi進行的存活素基因敲除，可以通過Smartflare“星光”探針和qRT-PCR的檢測加以區別。

(A) 通過Smartflare“星光”探針技術和流式細胞儀分析測定，可以得到在具有或沒有存活素敲除的情況下的LNCaP細胞中存活素表達。

(B) 通過qRT-PCR測定，求證了LNCaP細胞中有和沒有存活素敲除情況，存活素的相對表達水平。

由于Smartflare“星光”探針技術檢測的是單一的無損細胞中的基因表達，由此我們可以獲取各種經不同方式處理過的細胞的分布信息。在此我們特別觀察到，受存活素特異性Smartflare“星光”探頭處理過的LNCaP細胞的生存信號具有單峰式分布，而在SCC12細胞中是雙峰分布。

單個活細胞的胞內基因表達

研究結果表明, Smartflare“星光”探針技術可以檢測單個活細胞的胞內基因表達。這種能力對涉及RNAi(RNA干擾)介導的基因敲除的研究至關重要, 尤其是在還未確定不完整敲除原因的情況下。由于使用這種探針技術可以檢測單個細胞的基因敲除的不同程度，以得到關于基因表達的細胞與細胞間的演變、基因敲除和siRNA的滲透效率的信息。這些信息對解釋通過RNAi處理后所得到的分析結果非常有用。此外, 探針技術還允許實現細胞的分選和培養回收, 從而使得相同的細胞樣本能夠再用于后續分析, 諸如抗體染色, 流式細胞儀和qRT-PCR檢測等。可以說，測量基因敲除后的同種單個細胞樣品內的生理變化成為可能, 這對于考察基因表達和細胞表型之間的相關性來說有重要意義。

細胞內的基因表達

在研究通過RNAi介導的基因敲除時，難點在于找出某種不完全敲除根源的所在。尤其是傳統RNA定量檢測(測的是平均RNA水平)，無法區分基因敲除失效的原因，是因siRNA序列的設計不良?還是因siRNA未滲透到目標細胞,?還是由于目標細胞內的內源性基因表達差異太大?因此，進行單個活細胞的胞內基因表達的檢測就有著決定性的意義。