對毒品的分析必須可靠且能夠承受負載,其分析結果往往對法律訴訟程序起到決定性作用。而今,自動化SPE-GC/MS方法可替代傳統手工或半自動方法,應用該方法能在最大限度減少分析誤差的同時提高工作效率。
大麻屬于流行毒品,因駕駛員吸食大麻而致的交流事故屢見不鮮。在德國,若在機動車駕駛者的血液中查出大麻成分Δ9-四氫大麻酚(THC)高于1ng/ml的話,不僅會被罰款,而且還可能受到禁止駕駛的處罰。此外,鑒于長期吸毒者在交通行駛過程中喪失脫離毒癮的能力,因此相關部門還可能永久吊銷其駕照。
吸食毒品取證
法庭上具有重要意義的因素調查,是借助于在法醫毒物學實驗室中對大麻有效成分四氫大麻酚進行的檢測。“血液中較高的THC值所產生的實際影響,可以同交警在血液控制中的酒精含量那樣相比較。”基爾市石勒蘇益格-荷爾斯泰因州立大學附屬醫院法醫研究所的法醫Gertrud Rochholz博士如是稱。當驗證血液中有11-羥基Δ9-四氫大麻酚(THC-OH)時,表明是在不久之前吸食毒品;而血液中含有較高的11-nor-9羧基Δ9-四氫大麻酚(THC-COOH)則表示屬于長期吸毒。原則上,一旦發現駕駛員長期依賴毒品則可長期吊銷其駕照。只有當事人經過數月的尿液和頭發檢測證明確已戒毒,才能恢復駕駛資格。
圖1. Gerstel-SPE分析系統示意圖。
SPE-GC/MS作為標準方法
德國基爾市石勒蘇益格-荷爾斯泰因州立大學附屬醫院法醫研究所,原本采用預先進行樣品固相萃取的氣相色譜,耦合以質譜檢測器的方法(SPE-GC/MS)檢測血液中的THC、THC-OH和THC-COOH。Rochholz博士介紹:將1ml血清與1ml乙酸以及經過重氫化了的上述3種分析溶質的模擬物質作為內標混合。于自動樣品固相萃取系統(ASPEC-System吉爾森公司)設備上,將樣品溶液通過反相預處理柱UCT (C18ec,3ml,200mg)進行萃取。在后續步驟中將洗脫液蒸發,殘渣則采用衍生劑N-甲基-N-(三甲基硅烷)-三氟乙酰胺(MSTFA)加以溶解。分析溶質的衍生化于分流/無分流進樣器的導入管之中進行,再在氣相色譜/質譜儀上以單離子檢測掃描模式(SIM)測定。Gertrud Rochholz博士對于該方法的評價是:“這是一種半自動化的分析過程,但較為費時,要求進行許多手工步驟和操作,且耗費大量的溶劑和血清樣品,我們的目標是讓該分析過程更加高效。”而后該法醫研究所和Gerstel公司合作,實現了對現有SPE-GC/MS方法的全自動化,并且對方法進行了優化。
圖2. 用于固相萃取的標準預處理柱(下),對照以用作自動固相萃取的Gerstel預處理柱。
全自動SPE-GC/MS法
由于血清樣品需要經過固相萃取(SPE)過程,遂考慮于Gerstel多用性進樣器(MPS)的自動化樣品預處理時引入固相萃取。借此將在手動或者半自動操作中的工作步驟轉入到實驗室機器中,這意味著精度更高且更加可靠。“依賴于人工的手動操作過程必然會帶來一定的波動性。”Gerstel公司應用專家 Oliver Lerch博士如是解釋。通過將該公司引入市場的樣品制備機器人(MPS)與Maestro公司的控制軟件相結合,輕點鼠標就能夠將全部工作步驟和流程輕松地組合一起,并可以直觀修正。Lerch博士強調說:“不僅是SPE固相萃取,還包括所有的樣品預處理步驟, MPS進樣器將洗脫液在集成的GeratelmVAP蒸發器中于60℃進行蒸發,殘渣以MSTFA加以溶解,分取一部分進樣注射于GC/MS中”。
圖3. 采用自動化的SPE所得到的血清中的THC及其代謝產物的驗證譜圖。0.5ml血清樣品的萃取采用1ml SPE柱(100mg
C18ec);1ml血清樣品采用3ml預處理柱。衍生劑為40μl MSTFA。 對于0.5ml血清樣品采用1ml預處理柱和25μl MSTFA。
自動化SPE及進樣細節
由于多用性自動進樣器MPS的固相萃取要求采用與其適配的標準固相萃取預處理柱,遂選用了相同類型的柱型(Macherey & Nagel, C18ec, 3ml,200mg)作為對照。
比較實驗對兩類短柱產生了相似的效率。由于旨在尋求應用更小的樣品量和更少的溶劑體積,可以設想,若采用更小尺寸的同一類M&N預處理柱,那么同樣會大有希望的結果,該設想已得到實驗的證實(如圖3所示)。
圖4. GC/MS全套完整系統圖,配備有Gerstel雙塔變通型多用性自動進樣器MPS以及多位蒸發站。
全自動化系統
Lerch博士根據多年經驗得出結論,只有在實踐中行之有效的才能算得上好方法。基爾法醫研究所原來通過手動或半自動的方式進行的THC及其代謝產物THC-OH和THC-COOH的SPE-GC/MS測定,已成功地轉移到全自動化系統中。Rochholz博士稱:“樣品用量已成功降低,血清體積從1ml減少至0.5ml,所用的SPE預處理柱尺寸以及溶劑用量也相應減少”。不僅是每次的分析成本有所降低,還免去了手動操作,從而能夠提升實驗室的工作效率。應用專家Lerch博士談及該分析方法的評價時稱:“血清中THC及THC-OH的檢測限已經小于1ng/ml。對于3種化合物測量重現性(誤差)平均為5%,并未發現樣品的遺留污染”。驗證THC、THC-OH和THC-COOH的SPE-GC/MS方法,符合法醫毒物學實踐的要求(德國毒物學和法醫協會)。此外還有許多法醫研究所也對該方法表示興趣。令Rochholz博士感到欣慰的是:“該SPE-GC/MS系統不僅適用于上述化合物的驗證,而且還為毒物學家提供在其他領域應用的可能性”。
固相萃取
傳統的固相萃取方式需要使用大量的有毒溶劑,再將溶劑蒸發以富集分析溶質,才能達到所要求的檢測限,為此往往需要進行許多費時的手動操作步驟。通過引入實驗室機器手來進行固相萃取,可以將樣品預處理步驟完全實現自動化。