圖1. 從Agilent 1200系列LC系統到Agilent 1290 Infinity LC系統的方法轉換。
本文對Agilent 1290 Infinity液相色譜系統用于測定鹽酸胃復安藥物制劑中的雜質和有關物質的性能進行了評價。1200系列HPLC系統上的常規LC方法很容易轉換為Agilent 1290 Infinity LC系統上的超高壓方法，溫度精確調節是使不同雜質得到相同選擇性的關鍵參數。在此方法開發過程中施加的壓力高達1070 bar。最終的高效方法在880 bar下操作，分析時間為3.5min，比原來的HPLC方法快4倍左右，且具有同樣的準確度。驗證研究證明了Agilent 1290 Infinity LC系統的性能。采用新的二極管陣列檢測器（DAD）使雜質的檢測限低至相當于主化合物的0.001% w/w，比要求的檢測限還要低一個數量級。
目前藥物分析的關鍵詞是高通量、高效率和高分離度。高效率的目標就是在所開發和驗證方法的準確度、精密度和重現性保持不變的前提下，開發比當前所用方法約快4~5倍的分析方法。在液相色譜（LC）中，加快分析速度的方法包括使用填料粒度小于2μm的色譜柱和/或在高溫下操作。采用填料粒度小于2 μm 的色譜柱，與常規方法相比，可以在更高的線性流速下操作，但需要專用的LC儀器。
我們用Agilent 1290 Infinity LC系統測定了鹽酸胃復安制劑中的雜質。該系統配置了高壓泵，輸液壓力高達1200 bar，以及新的快速而靈敏的二極管陣列檢測器（DAD）。方法開發包括從配置填充3.5μm 填料色譜柱的常規儀器（Agilent 1200 系列LC系統），向配置1.7μm填料色譜柱的UHPLC 系統（Agilent 1290 Infinity LC系統）上的條件轉換。通過比較兩個系統得到的數據，對各系統準確度、精密度和重現性進行了評價。
圖2.摩擦熱的生成對色譜柱選擇性的影響以及降低柱溫的效果。
實驗部分
儀器、試劑與材料
標準Agilent 1200 系列HPLC 系統和Agilent 1290 Infinity LC系統。
圖3. 用最終的Agilent 1290 Infinity LC系統方法得到的結果。
試劑與材料
雜質和有關物質的儲備溶液用甲醇配制,儲備溶液與水混合并稀釋成適當濃度。制劑是鹽酸胃復安水溶液（5mg/ml）與某些其它物質（保密配方）混合制成的注射劑。
圖4. 制劑（上圖）及添加了LOD濃度水平雜質1到9的制劑（中圖：0.001% w/w；下圖：0.005% w/w）。條件見圖3。
結果與討論
LC與1290 Infinity LC系統的方法轉換
原來的方法是在使用四元泵帶線性分離的1200 系列HPLC 上開發的。制劑添加了0.5% w/w 的色譜圖如圖1A所示。使用的色譜柱是XBridge C-18 柱，填充3.5μm粒度填料，初始壓力為140 bar。只要將某些儀器的差異考慮進去，該方法可以輕松轉換到1290 Infinity LC系統上。如果將方法參數直接拷貝到1290 Infinity LC系統上，保留時間將明顯縮短。由于兩個系統的延遲體積不同，選擇性也發生了改變。四元泵的延遲體積是950μl，而1290 Infinity 二元泵的延遲體積已減少到了10 μl。我們在1290 Infinity LC 方法中引入了一段初始等梯度持續時間來補償這一差異。經過這種直接修正，兩個系統的保留時間和選擇性非常相似，而1290 Infinity LC 的效率比1200 系列更高（未顯示色譜圖）。
然后將方法轉換到填充1.7μm填料的內徑為2.1mm 的BEH C18 柱上。為了保持兩個柱子上的線速度相同，將流速減小到0.22 ml/min，同時將進樣量從2μl減少到0.8μl，壓力為380bar。為了補償延遲體積的差異，在梯度中引入了0.5min的初始持續時間。這些條件下的結果與用3.5μm 填料色譜柱非常相似（圖1B），但得到結果（圖1A）的速度稍快。
使用1290 Infinity LC設置，柱效和分離度明顯提高。理論塔板數可以用柱長與2倍粒徑之比進行粗略計算。因此，1.7μm 填料柱的柱效應為3.5μm 柱的兩倍。由于分離度與柱效的平方根成正比，所以，在同一系統上分離度應提高1.4 倍。在這個特例中，分離度的提高比理論預計高得多（例如峰1和峰2的分離度從2.6提高到5.9）。這歸功于Agilent 1290 Infinity LC系統更低的死體積和更卓越的泵驅動。
1290 Infinity LC系統提高分析速度
在1.7μm粒度色譜柱進行分析時壓力是380 bar，遠遠低于1290 Infinity LC系統泵的1200 bar的壓力上限。因此，還可以通過增大流速來縮短分析時間。當增大流速時，為了保持相同的洗脫曲線，應按流速的增加比例縮短梯度時間。
當流速從0.22ml/min加快到0.66 ml/min時，操作壓力從380 bar增加到了1020 bar。正如預期的一樣，色譜柱在非常高的壓力或高流動相線速度條件下，產生了摩擦熱。由于分析物中某些組分的保留與溫度有關，所以我們注意到，在高流速下色譜柱的選擇性有所不同。可以看出，主成分和化合物5之間、化合物7 和8的分離度尤其受溫度變化的影響（圖2A）。
將柱溫從37℃降低到32℃，可以抵消熱效應（圖2B）。在該條件下，在4.5~5min內就可實現良好分離，與原來的LC相比，時間縮短了3 倍。然而當壓力增加到1070 bar時，所用色譜柱卻只能耐受1000 bar 的壓力。色譜柱在比最大耐受壓力更高的壓力下使用更長時間后，柱壽命和方法的耐用性會明顯降低。
因此，對于常規應用，若柱長從150 mm減少到100 mm，在0.66 ml/min 流速下形成的最大反壓為880 bar。進一步縮短梯度持續時間和梯度時間來保持原方法的選擇性。該方法總分析時間是3.5min，而原來用3.5μm 粒度色譜柱時總分析時間為15.5min（圖3）。初始峰的分離度是3.8，這仍比用1200 系列LC系統得到的數值高。
方法驗證
采用圖3的條件，測定了線性、進樣重現性和檢測限（表4）等參數。得到良好的線性（所有化合物均大于0.999）和進樣精度。RSD 在0.005% 左右，接近檢測限（LOD）的某些化合物的RSD 均低于8%，大多數化合物的RSD 低于3.5%。這都在該濃度水平的合格限內。在LOD 分析的色譜圖見圖4。LOD 相對于主要化合物（柱上50–250 pg）， 在0.001% w/w 到0.005% w/w 之間波動。這說明，雜質水平低于報告閾值10 到50 倍時仍可被檢測到。
結論
本應用報告證明了將現有HPLC方法轉換為Agilent 1290 Infinity LC系統方法的可行性。開始，我們將在1200 系列LC上建立的HPLC 分析方法簡單移植至1290 Infinity LC系統上。如果考慮了某些儀器特征，該方法轉移將相對簡單。然后把原來的色譜柱（150 mm × 3.0mm，3.5μm 粒度）換成粒度更小的（1.7μm）窄內徑（2.1mm）柱。此轉換使化合物之間的分離度顯著增加。使用小于2 μm 填料的色譜柱可以通過提高流動相的線速度縮短分析時間，而且不會影響分離度。在高壓和高流動相流速條件下產生的摩擦熱改變了方法的選擇性。為了維持原來的選擇性，將色譜柱溫度的設置降低。
最終的Agilent 1290 Infinity LC系統分析是在100mm柱上進行的，壓力為880 bar，比原來的HPLC 方法快4倍。該Agilent 1290 Infinity LC系統方法已得到成功驗證。檢測限隨著相當于柱上50~250 pg 的主化合物在0.001%w/w 到0.005%w/w 之間變化，這比要求的報告濃度水平低10~50倍。
