圖1. 碳酸鈣晶體（方解石）、不含結晶水的碳酸鈣也作為文石和球文石出現。
長期以來，關于在結晶析出之前還存在穩定的離子簇的觀點，一直未能從實驗上加以證實。對于碳酸鈣而言，這種結構可以借助于由測定鈣的電位滴定法和超離心分析法所組成的精細實驗計劃加以驗證。
碳酸鈣（見圖1）具有巨大的經濟、工業和科學意義。它廣泛用于建材、鋼鐵工業，并可在農業中作為肥料，在造紙和顏料工業中作為填充劑。此外，碳酸鈣還是蟹蝦、貝類和蝸牛類外殼的主要礦物質成分。貝類外殼的95%系由碳酸鈣組成。如果將其抗斷裂強度與純的礦物碳酸鉀相比較，會很快發現貝類要比這種礦物質的強度高出3000倍以上。這種大大改進的抗斷裂強度可以歸因于該生物礦物的復雜的納米結構，這種結構能夠使得礦物的裂紋難于繼續擴大。假如能夠復制出這樣結構的礦物的話，那么將會立即開發出革命性的材料并且有可能應用到建筑技術和醫學中去。因此材料科學家們很想知道，這些生物如何能夠影響礦物的生長。今天生物礦物化過程已經成為許多研究工作的重心。
碳酸鈣結晶的負面形象
有些時候碳酸鈣的析出是不受歡迎的。比如鈣離子是增大水的硬度的主要原因，鈣離子主要是以碳酸鈣的形式從洗衣機、洗碗機以及工業加熱和冷卻循環水中析出。根據源水中硬度的多少，必須在洗滌劑、洗碗機中或者工業用水中加入一些除鈣劑。盡管應用了除鈣劑，每年全部工業世界為消除這種礦物質沉淀而引起的費用仍然高達500億美元之多。
圖2. 帶萬通公司滴定系統的裝備結構：將鈣離子濃度的測量與稱重進行比較（見于顯示器中），結構表明，鈣離子被結合時與簇化物的pH-值有關。
結晶過程的早期階段是決定性的
如果想要控制從離子的水溶液中產生結晶的過程，就必須從分子機理上加以了解。這種從溶解狀態到固相狀態的過程叫做成核過程。這一成核的基本理論是1935年由Richard Becker 和Werner Doering 整理而成，迄今仍被為視為一種經典成核理論。可是當涉及到生物礦化問題時這一學說便遇到了難題。而有一種概念認為，在結晶的成核反應開始之前必定具有一種穩定的結晶前身，由此可以更好地解釋所謂的非經典的結晶路徑。就本文涉及的情況來說，這種以碳酸鈣簇的物種存在的概念已經被提出并得到了計算機模擬的支持，然而長期以來一直未能用實驗予以證實。
分析證實還是問題？
碳酸鈣是一種難溶于水的物質，所以其游離存在的離子以及在成核反應之前所達到的簇離子濃度都是非常小的。另一方面這些離子和所期待的簇離子又都是很小的。在不同的研究論文中，碳酸鈣的結晶是借助于時間解析的小型和廣角倫琴射線法（TR-SAXS/WAXS）加以研究的。此時在很短的時間范圍內讓稀的鈣離子和碳酸根離子混合以產生成核反應。在成核反應之前所形成的物種的檢測由于兩方面的原因變得困難。其一，可供支配的時間太短，無法觀察早期階段。其二，在如此小的濃度下對如此小的結構通過散射加以檢測也是一種很大的挑戰。因此所能證實的只能是于成核反應之后形成的無定形的碳酸鈣顆粒而已。顯而易見，如要能夠證實這種早期的碳酸鈣簇化物，就應該盡可能地減慢溶液的過飽和進程，以便有足夠的時間來觀察早期的階段。而涉及簇化物過小的粒度和過小濃度的問題，則可采用驗證游離離子總濃度的間接方法予以對付。
圖3. 背景所示為帶有檢測光學儀器的超濾分析用的轉子。前面為由離子和簇化物2元成分組成的體系，在離心場中測量到的濃度隨時間而變化的示意圖。
借助結合滴定法的電位測量進行證實
一種可行的分析方法是：將所測量的游離離子的濃度用稱量的方法加以比較。這一目的只有通過精密控制的實驗才能實現。當某一稱量為已知時，必須測出游離的鈣離子和碳酸根的濃度。將稀的鈣溶液以恒定的速率加入到稀的碳酸根緩沖液，由此調節漸進過飽和過程，這樣便能夠實現這一方案。由于這兩種離子的濃度是已知的，所以每一時刻的稱重也是已知的。 游離的鈣離子濃度可以借助一種鈣離子選擇電極采用測量其電化學電勢的方法進行測定（見圖2）。目前還沒有這類碳酸根的離子電極，當碳酸根離子結合到簇化物或顆粒物中時，便導致溶液pH-值的下降。如果采用滴定法用滴入稀的氫氧化鈉溶液將pH-值維持恒定，則可根據所消耗的氫氧化鈉用量計算出被結合的碳酸根的離子的量。
實驗表明，等量的鈣和碳酸根離子在成核反應之前相結合，而一部分游離的離子則“消失”于另外一種結構中。開始階段游離離子的濃度直線上升，但斜率較之于稱量要平緩一些。在成核反應之后（游離離子）濃度急據下降，最后達到沉淀的碳酸鈣（固）相的溶度積的濃度。
這一結果還不能證明碳酸鈣簇化物就此形成。只有在顯示了所結合的鈣離子濃度與碳酸根濃度有關，或者反過來，所結合的碳酸根離子與鈣離子濃度有關，才算得到了證明。緩沖液中碳酸根的提高引起了pH-值的提高，由此也加強了對鈣離子的結合，在pH 9 時所加的鈣中約有35%，而pH 10 的時候則有75%被結合到電中性的碳酸鈣簇化物中。除了這種對于簇化物的定性證明之外，實驗還表明，能夠對簇化物形成的化學平衡以及沉淀的無定形結構的溶度積從物理化學上進行定量計算。
圖4. 對于成核反應概念的經典的和新式的（變通的）的理解比較。不同的過度形態提供了對結晶過程施加影響或者進行控制的可能性。
超濾分析的直接證明
超濾分析（對于簇化物）可以是一種獨立的和直接的證明。采用的裝備為一種以極高角速度旋轉的轉子，其離心力可以達到地球加速度的300?000倍。在這樣一種離心場中甚至可能將溶解的離子變成沉積物。在所給定的轉速和溶劑條件下，其沉淀的速度取決于沉積質點的質量、密度和形態。對于簇化物而言，可以期待具有比單個離子更高的沉積速度。離子和簇化物沉積帶的運動（見圖3）可以借助于一種可以測出最微小的光折射指數的瑞利干涉光譜儀進行觀察。根據沉積速度可以采用質點密度測量出質點的大小。在實驗進程中根據擴散形成了兩種沉積帶。于是在成核反應簇化物之前可以采用滴定實驗來證實在溶液中沉積的離子。此外還可以估計質點的大小約為2nm，相應于在單個簇化物中共計有70個鈣和碳酸根離子。此外緊靠成核反應之前和之后，還發現有較大的簇化物，這一事實表明成核反應與簇化物的總量有關（見圖4）。
對未來簇化物研究的挑戰
穩定的簇化物提出了一種迄今尚未認知的結構，這種結構可能在生物意義上或者人工合成晶體加合物方面發揮作用。滴定實驗允許對這類加合物的作用方式加以區別和確定特性。現在有可能對結晶過程更好地進行理解。而對于生物礦化的這類新的機理應當加以關注。看來也有可能基于這種新的知識去開發出新型的除鈣劑。從科學的意義考慮將同時開啟一種新的研究領域。一方面應當對簇化物更好地確定其特性，包括結構、化學平衡的動力學、以及通過聚集物而成核的機理等等。另一方面要找出這種新的變動的成核機理是否是一種例外抑或是礦化過程中普遍性的規律。迄今已經能夠定性地指出，這種簇化物的形成在生物礦物磷酸鈣結晶中（例如骨頭、牙齒）和草酸鈣（例如腎結石）中出現。最后還需考慮一種也許現在還不甚明朗的因果關系。眾所周知，碳酸鈣的礦藏結合了巨大數量的二氧化碳，可是在大洋里也已形成的簇化物中附帶結合的CO2卻迄今未被考慮。大洋的酸化會導致簇化物的溶解而最終強化了溫室效應。這一影響也必須進行量化。