熒光原位雜交（Fluorescenceinsituhybridization,FISH）

實驗原理

熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一門新興的分子細胞遺傳學技術，是20世紀80年代末期在原有的放射性原位雜交技術的基礎上發展起來的一種非放射性原位雜交技術。目前這項技術已經廣泛應用于動植物基因組結構研究、染色體精細結構變異分析、病毒感染分析、人類產前診斷、腫瘤遺傳學和基因組進化研究待許多領域。

FISH的基本原理是用已知的標記單鏈核酸為探針，按照堿基互補的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進行異性結合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而可以探針直接與染色體進行雜交從而將特定的基因在染色體上定位。與傳統的放射性標記原位雜交相比，熒光原位雜交具有快速、檢測信號強、雜交特異性高和可以多重染色等特點，因此在分子細胞遺傳學領域受到普遍關注。

雜交所用的探針大致可以分類三類：

1）染色體特異重復序列探針，例如α衛星、衛星III類的探針，其雜交靶位常大于1Mb，不含散在重復序列，與靶位結合緊密，雜交信號強，易于檢測；

2）全染色體或染色體區域特異性探針，其由一條染色體或染色體上某一區段上極端不同的核苷酸片段所組成，可由克隆到噬菌體和質粒中的染色體特異大片段獲得；

3）特異性位置探針，由一個或幾個克隆序列組成。

探針的熒光素標記可以采用直接和間接標記的方法。間接標記是采用生物素標記DNA探針，雜交之后用藕聯有熒光素親和素或者鏈霉親和素進行檢測，同時還可以利用親和素-生物素-熒光素復合物，將熒光信號進行放大，從而可以檢測500bp的片段。而直接標記法是將熒光素直接與探針核苷酸或磷酸戊糖骨架共價結合，或在缺口平移法標記探針時將熒光素核苷三磷酸摻入。直接標記法在檢測時步驟簡單，但由于不能進行信號放大，因此靈敏度不如間接標記的方法。

實驗用具及材料

相關溶液的配制

1）20×SSC：175.3g NaCl，88.2g檸檬酸鈉，加水至1000mL（用10mol/L NaOH調pH 至7.0）。

2）去離子甲酰胺（DF）：將10g混合床離子交換樹脂加入100mL甲酰胺中。電磁攪拌30min，用Whatman l號濾紙濾。

3）體積分數70％甲酰胺/2×SSC：35mL甲酰胺，5mL 20×SSC，10mL水。

4）體積分數50％甲酰胺/2×SSC：100mL甲酰胺，20mL 20×SSC，80mL水。

5）體積分數50％硫酸葡聚糖（DS）：65oC水浴中融化，4oC或-20oC保存。

6）雜交液：8μL體積分數25％DS，20μL 20×SSC混合。（或40μL體積分數50％DS，20μL 20×SSC，40μL ddH2O混合）取上述混合液50μL，與5μL DF混合即成。其終濃度為體積分數10％DS，2×SSC，體積分數50％DF。

7）PI/antifade溶液

PI原液：先以雙蒸水配置溶液，濃度為100μg/mL，取出1mL，加39mL雙蒸水，使終濃度為2.5μg/mL。Antifade原液：以PBS緩沖液配制該溶液，使其濃度為10mg/mL,用0.5mmol/L的NaHCO3調pH值為8.0。取上述溶液1mL，加9mL甘油，混勻。

PI/antifade溶液：PI與antifade原液按體積比1:9比例充分混勻，－20oC保存備用。

8）DAPI/antifade溶液：用去離子水配制1mL/mg DAPI儲存液，按體積比1:300，以antifade溶液稀釋成工作液。

9）封閉液I：體積分數5％BSA 3mL，20×SSC 1mL,ddH2O 1mL,Tween20 5μL混合。

10）封閉液II：體積分數5％ BSA 3mL,20×SSC 1mL,goat serum 250μL,ddH2O 750μL,Tween20 5μL混合。

11）熒光檢測試劑稀釋液：體積分數5％ BSA 1mL，20×SSC 1mL,ddH2O 3mL,Tween20 5μL混合。

12）洗脫液：100mL 20×SSC，加水至500mL，加Tween20 500μL。

實驗方法及步驟

1）探針變性

將探針在75oC恒溫水浴中溫育5min，立即置0oC，5～10min，使雙鏈DNA探針變性。

2）標本變性

①將制備好的染色體玻片標本于50oC培養箱中烤片2～3h。（經Giemsa染色的標本需預先在固定液中退色后再烤片）。 
②取出玻片標本，將其浸在70～75oC的體積分數70％甲酰胺/2×SSC的變性液中變性2～3min。 
③立即按順序將標本經體積分數70％、體積分數90％和體積分數100％冰乙醇系列脫水，每次5min，然后空氣干燥。

3）雜交

將已變性或預退火的DNA探針10μL 滴于已變性并脫水的玻片標本上，蓋上18×18蓋玻片，用Parafilm封片，置于潮濕暗盒中37oC雜交過夜（約15～17h）。由于雜交液較少，而且雜交溫度較高，持續時間又長，因此為了保持標本的濕潤狀態，此過程在濕盒中進行。

4）洗脫

此步驟有助于除去非特異性結合的探針，從而降低本底。

（1） 雜交次日，將標本從37oC溫箱中取出，用刀片輕輕將蓋玻片揭掉。 
（2） 將已雜交的玻片標本放置于已預熱42～50oC的體積分數50％甲酰胺/2×SSC中洗滌3次，每次5min。 
（3） 在已預熱42～50oC的1×SSC中洗滌3次，每次5min。 
（4） 在室溫下，將玻片標本于2×SSC中輕洗一下。 
（5） 取出玻片，自然干燥。 
（6） 取200μL復染溶液（PI/antifade或DAPI/antifade染液）滴加在玻片標本上，蓋上蓋玻片。

5）雜交信號的放大（適用于使用生物素標記的探針）

（1） 在玻片的雜交部位加150μL封閉液I，用保鮮膜覆蓋，37oC溫育20min。 
（2） 去掉保鮮膜，再加150μL avidin-FITC于標本上，用保鮮膜覆蓋，37oC繼續溫育40min。 
（3） 取出標本，將其放入已預熱42～50oC的洗脫液中洗滌3次，每次5min。 
（4） 在玻片標本的雜交部位加150μL封閉液II，覆蓋保鮮膜，37oC溫育20min。 
（5） 去掉保鮮膜，加150μL antiavidin于標本上，覆蓋新的保鮮膜，37oC溫育40min。 
（6） 取出標本，將其放入已預熱42～50oC的新洗脫液中，洗滌3次，每次5min。 
（7） 重復步驟(1)、（2）、（3），再于2×SSC中室溫清洗一下。 
（8） 取出玻片，自然干燥。 
（9） 取200μL PI/antifade染液滴加在玻片標本上，蓋上蓋玻片。

6）封片

可采用不同類型的封片液。如果封片液中不含有Mowiol（可使封片液產生自封閉作用），為防止蓋片與載片之間的溶液揮發，可使用指甲油將蓋片周圍封閉。封好的玻片標本可以在—20～—70oC的冰箱中的暗盒中保持數月之久。

7）熒光顯微鏡觀察FISH結果

先在可見光源下找到具有細胞分裂相的視野，然后打開熒光激發光源，FITC的激發波長為490nm。細胞被PI染成紅色，而經FITC標記的探針所在的位置發出綠色熒光。

所用不同熒光材料的激發光和發射光波長及濾光鏡選擇