CRISPR實驗利器：BTX電轉儀

什么是 CRISPR?

CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）, 是細菌中用于與病毒進行斗爭的免疫武器。 生命進化歷史上，細菌為了將病毒的外來入侵基因清除，進化出 CRISPR 系統，利用這個系統，細菌可以不動聲色地把病毒基因從自己的染色體上切除，這是細菌特有的免疫系統。這種切除功能其中比較典型的模式是依靠一個復合物，該復合物能在一段 RNA 指導下，定向尋找目標 DNA 序列（圖 1），并招募一個蛋白（如 Cas9）（圖 2）,Cas9 能夠將該序列進行切除（圖 3）。正是基于細菌的這種后天免疫防御機制，CRISPR/Cas9 技術應運而生，從而使科學家們利用 RNA 引導 Cas9 核酸酶實現對多種細胞基因組的特定位點（如 NHEJ 非同源性末端接合) (圖 4) 進行修飾。

為什么要電轉？

CRISPR 革命已經開始，將 CRISPR 結構導入特定細胞 (如干細胞、神經細胞、造血細胞、受精卵, 等等) 用普通地方法往往很困難。電穿孔技術可使這些細胞在精確的電脈沖作用下，在細胞膜上形成瞬時的空隙，從而誘導 CRISPR 結構通過這些空隙進入細胞中。在電脈沖撤離后，細胞恢復原有狀態，這種物理學的方式并不影響細胞內部任何代謝及生理變化。

BTX 電轉和 CRISPR

外源物質如何高效的進入目的細胞是進行表達修飾實驗（CRISPR、基因編輯、基因工程）成功的關鍵。BTX 電穿孔系統由于它的易用性、重復性、高效率和低毒性，已經成為將 CRISPR 結構導入細胞（如哺乳動物細胞、細菌、酵母、植物、寄生蟲等）的重要手段。

使用 BTX 系統可進行多種類型轉染；

體外培養--貼壁細胞、懸浮細胞及原代細胞·在體·在卵內·在子宮內·離體

使用 BTX 系統可轉染 CRISPR 到多種細胞，包括很多難轉染的細胞。

神經細胞 ? 原代細胞 ? 免疫細胞 ? 胚胎細胞 ? 受精卵 ? 寄生細胞

Why BTX?

（一）使用新的卵母細胞電極進行卵母細胞/胚胎電轉

卵母細胞電極:
● 可用于高通量小鼠卵母細胞、受精卵或者胚胎的 CRISPR/Cas9 基因編輯
● 易于使用，快速，高通量
● 每次可以操作 20 – 40 個卵母細胞
● 電轉過程可視
● 容易收集電轉后所有的胚胎細胞

在動物模型中，使用 BTX 卵母細胞電極配件，可以高效率、 高通量進行店轉實驗。

使用不同的電極存活率不同

（二）使用 BTX 電轉儀將 CRISPR/Cas9 質粒轉染進難轉染的細胞。例如：Taxoplasma gondii 

A) 在 Taxoplasma gondii 細胞中，CRISPR 質粒 (pU6-SAG1) 切斷 SAG1 位點

B) 成功轉染的細胞 (綠色) 與 模擬（mock）轉染細胞比較

來源:
Efficient Genome Engineering of Toxoplasma gondii using CRISPR/Cas9 Sidik SM, et al., 2014
Plos One, volume 9, Issue 6, July 2014