HPLCUV快速檢測原奶中的三聚氰胺

圖1.  低濃度標樣線性。

本文采用北京普析通用儀器有限公司的L6系列高效液相色譜儀，北京艾杰爾科技的三聚氰胺快速分析柱，建立了原料乳中三聚氰胺的HPLC-UV快速檢測方法。原料乳中的三聚氰胺經GB/T22400-2008的標準方法處理后，使用0.050mol/L的磷酸鹽緩沖液和乙腈為流動相，采用高效液相色譜儀進行測定，最低檢測限為0.0032mg/L，回收率為103.6%~105.2%，0.005~50mg/L之間有良好的線性關系（R>0.9999）。結果表明，本方法簡便、快捷、準確，適合大批量樣品的測定。

三聚氰胺，簡稱三胺，分子式C3N6H6，是一種重要的氮雜環有機化工原料。由于三聚氰胺分子中含有大量氮元素，而普通的全氮測定法測奶粉和食品中的蛋白質含量時不能排除這類偽蛋白氮的干擾，因而一些廠商為了降低成本而添加這種化工原料，以提高產品中蛋白質含量。《國際化學品安全手冊》第三卷和國際化學品安全卡片說明：長期或反復大量攝入三聚氰胺可能對腎與膀胱產生影響，導致產生結石。近期的“三鹿奶粉”事件，就是因為不法分子摻賣混有三聚氰胺的奶粉，導致許多嬰兒腎結石，造成了嚴重的后果。本文采用北京普析通用儀器有限公司的L6-1系列高效液相色譜儀和北京艾杰爾科技的三聚氰胺快速分析方法包，依據GB/T22400-2008《原料乳中三聚氰胺快速檢測 液相色譜法》建立原奶中三聚氰胺快速、準確的檢測方法。

實驗部分

儀器與試劑

儀器：L6-1系列高效液相色譜儀（北京普析通用公司），包括L6-P6二元高壓輸液泵，L6-UV6可變波長紫外檢測器；三聚氰胺快速分析方法包（北京艾杰爾科技有限公司）：包括Venusil M-SCX，5μm，4.6×250mm強陽離子交換柱（科技部“十一五”國家支撐計劃成果）及保護柱；針式過濾器（Agela Clarify，0.22/0.45μm，尼龍/MCM）；三聚氰胺標準品（>99%）；空白原奶樣品（北京奶牛中心提供）。

圖2.  高濃度標樣線性。

試劑：所用乙腈為色譜純；磷酸二氫鉀為分析純；水為超純水。

色譜條件

色譜柱：Venusil SCX-M色譜柱（4.6×250mm，5μm，150?）（科技部“十一五”國家支撐計劃成果）；流動相：磷酸二氫鉀（0.050mol/L）：乙腈=70:30（流動相不需調整pH值）；流速：1.5ml/min；柱溫：室溫；波長：240nm；實驗中若非特別注明，進樣量均為20μl。

圖3.  重復性譜圖。

試樣的制備

稱取混合均勻的14.89g原料乳樣品（準確至0.01g），置于50ml具塞刻度試管中，加入30ml乙腈，劇烈振蕩6min，加水定容至滿刻度，充分混勻后靜置3min，用一次性注射器吸取上清液用針式過濾器過濾后，作為高效液相色譜分析用試樣。

圖4.  檢出限譜圖。

三聚氰胺標準曲線工作液的配制

■三聚氰胺標準貯備溶液：1.00×103mg/L：稱取100mg三聚氰胺標準物質（準確至0.1mg），用水完全溶解后，100ml容量瓶中定容至刻度，混勻。

標準工作溶液

■標準溶液A：2.00×102mg/L：準確移取20.0ml三聚氰胺標準貯備溶液，置于100ml容量瓶中，用水稀釋至刻度，混勻，待用。

圖5.  空白原奶樣品測試及重復性。

■標準溶液B：0.50mg/L：準確移取0.25ml標準溶液A，置于100ml容量瓶中，用水稀釋至刻度，混勻，待用。

■標準工作液的配制

表1. 標準工作液配制（高濃度）

按表1分別移取不同體積的標準溶液A于容量瓶中，用水稀釋至刻度，混勻，0.45μm濾膜過濾，待測。按表2分別移取不同體積的標準溶液B于容量瓶中，用水稀釋至刻度，混勻，0.45μm濾膜過濾，待測。

表2. 標準工作液配制（低濃度）

結果與討論

線性范圍

根據國標要求繪制低濃度和高濃度兩條標準曲線：低濃度曲線取0.005mg/L、0.01mg/L、 0.02mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L等5個濃度的標準樣品測試，所得標準曲線如圖1所示。高濃度曲線取0.2mg/L，0.5mg/L，2mg/L，5mg/L，20mg/L，50mg/L 6個濃度的標準樣品測試，所得標準曲線如圖2所示。

圖6.  實際原奶樣品添加標品疊加圖。

由圖1、圖2可以看出，在國標GB/T22400《原料乳中三聚氰胺快速檢測-液相色譜法》所規定范圍內，三聚氰胺峰面積和濃度均有良好的線性關系。

重復性

取濃度為5mg/L的標準品溶液，分別進樣20μL，進樣6次，計算保留時間及峰面積的RSD（相對標準偏差）。結果列于表3中。

表3.  保留時間和峰面積的重現性（精密度）

從表3和圖3看出，該方法結果重復性良好。

檢出限

以曲線最低點0.005mg/L的譜圖（見圖4）為準，以2噪聲對應峰高估算檢出限為0.0032mg/L，對應原料乳中的三聚氰胺含量為0.011mg/kg。

表4.  三聚氰胺樣品加標回收率試驗結果

實際樣品測試

■空白樣品的測定：對同一空白原奶樣品平行測定兩次，測試譜圖如圖5所示，表明結果重復性良好。

■實際原奶樣品加標回收率：分別在樣品中加入相當于0.5mg/L、2mg/L和5mg/L的三聚氰胺標準品，測試譜圖如圖6所示。

根據此譜圖測得三聚氰胺的加標回收率如表4所示，可以看出，本方法檢測實際奶樣中三聚氰胺高、中、低不同濃度回收率在103.6%~105.2%之間，滿足檢測要求。同時三聚氰胺能和樣品中的相似組分充分分離（分離度按加標濃度由低至高依次為2.724、2.707、2.727），避免了假陽性結果。

結論

通過上述實驗結果表明，使用普析通用儀器公司的L6-1系列高效液相色譜儀和艾杰爾科技的三聚氰胺快速分析方法包測定原奶中的三聚氰胺具有檢測限低，精密度高，線性范圍寬和回收率高等優點，證明了使用國產色譜儀和國產關鍵耗材，完全可以滿足奶制品中三聚氰胺的快速檢測要求。