染色質由真核基因組包裝而成，它參與了轉錄、復制、重組、修復等許多以DNA一蛋白質相互作用為基礎的生化過程。研究者感興趣的是這些過程涉及到哪些特異的基因或DNA序列,有哪些蛋白質參與。
盡管有許多人對染色質進行分類,就像Holde將其分為轉錄活性或非活性位點,但染色質構本身是動態的,并且DNA與非組蛋白相互作用常是瞬時的。因此極有必要發展一種方法,能夠研究生理狀態下DNA與蛋白質的結合,避免DNA結合蛋白在染色質上的重新定位或者在后續的生化分離中丟失。
由此產生了各種交聯方法,也即將活細胞或分離的成分用交聯試劑處理,如紫外光、甲醛DMS等,使蛋白質原位與DNA共價結合,研究兩者的瞬時相互作用。DMs與紫外光聯用盡管最近已成功用于研究體內DNA蛋白質相互作用,但是處理后對DNA造成損傷,故主要用于動力學上的研究。
而甲醛能介導蛋白質一蛋白質,蛋白質一DNA,蛋白質一RNA的交聯,這種交聯體外、體內均可進行,并且可被簡單并全逆轉,從而在生理狀態下分別對DNA和蛋白質進行分析。另外甲醛交聯的靈敏度高,交聯效率也比紫外光高百倍。
綜合以上優點該法已成為研究DNA和蛋白質體內瞬時作用的主要方法。甲醛交聯的機制是DNA堿基上的氨基與亞氨基與蛋白質上的a氨基及賴氨酸、精氨酸、組氨酸、色氨酸的側鏈氨基發生反應。
發展
甲醛交聯及染色質免疫沉淀方法是綜合利用了兩種方法的優點。甲醛將蛋白質固定在DNA上,免疫沉淀分離交聯的復合物,再經逆轉對兩者進行分分析。這種方法的成熟經歷了漫長的發展歷程。
最初使用甲醛作為交聯試劑可追溯到上個世紀六十年代,當時分離的染色質或核經甲醛固定一定時間,用氯化艷密度梯度離心研究新合成的組蛋白沿著新復制的DNA的分布。上個世紀七十年代,aJckson報道了對甲醛介導的交聯物進行逆轉,電鏡分析釋放出的組蛋白。
上個世紀九十年代初,免疫沉淀用于分離固定的復合物,vasrhavshy等〔`〕使用組蛋白抗體研究DNA與轉錄的關系,從而形成了甲醛交聯及染色質免疫沉淀的方法。上世紀九十年代,抗體滴度和特異性大大提高,比如針對組蛋白轉錄后修飾的乙酞化、磷酸化的特異性抗體相繼出現,為染色質修飾和基因表達活性等的研究大開方便之門。
在染色質結構和動力學中的應用
甲醛交聯及染色質免疫沉淀方法已成功用于研究染色質結構和染色質動力學等不同的領域中。研究對象涉及酵母、原蟲、果蠅仁、人體細胞以及古細菌毛等多種生物;內容集中在與染色質直接相關的蛋白質;范圍包括細胞信號通路,轉錄調節與組蛋白修飾的關系,古細菌核小體的組成等。
更為重要的是,該技術已在研究體內含量遠小于組蛋白的其他DNA結合蛋白或復合物中獲得成功。例如,果蠅中POYL-CoMB的基因組結合蛋白,以及哺乳動物T細胞和B細胞發育中,IK人ROS/HEHOS家族成員與中心粒異染色質區靜默基因的關系。
近來該方法又取得了突破性的進展,用于分析轉錄因子與內源基因的體內結合,打破了以往必須依賴體外方法尋找轉錄因子的DNA結合序列的局限。2000年Yougn等發展了芯片方法,檢測基因組水平上染色質蛋白的定位分析,這使得甲醛交聯及染色質免疫沉淀技術的應用更加方便、快速。
實驗介紹
將免疫沉淀與甲醛交聯聯用,首次鑒定出的是酵母中轉錄因子的目標基因序列。利用酵母作為研究材料一個很大的優點是其基因組已全部測序,因此可直接設計引物對免疫沉淀下的染色質作CPR驗證目的蛋白的DNA結合序列。
但是在生物發育中有許多調控因子是酵母所沒有的,eBne等改進了方法用于尋找高等哺乳動物中DNA結合蛋白調控的基因序列。本實驗室將幾種方法加以綜合,基本步驟見圖1,詳細的操作程序可參考文獻。
在這里需要指出的是,由于甲醛還介導了蛋白質與蛋白質之間的交聯,所以該程序使用丙酮回收免疫沉淀下的蛋白質,可以分析特定DNA序列上的蛋白質復合物。不過要注意在交聯物逆轉時不能用蛋白酶K消化,而直接用丙酮回收有機相中的蛋白質。
結語
細胞內有許多調節機制都是通過蛋白質的轉錄后修飾,蛋白質之間的相互作用,蛋白質與DNA間的相互作用等瞬時又嚴謹的變化來實現的。甲醛作固定劑,就好比是染色質瞬時事件的攝相機,免疫沉淀又能通過合適抗體的選擇富集特異的目的蛋白及相關DNA,而基因序列的富集更為重要。
所以甲醛交聯及染色質免疫沉淀的方法,開創了DNA一蛋白質體內相互作用研究的新時代。隨著染色質研究興趣的提高及高滴度、高特異性蛋白質抗體的獲得,該方法已成為體內研究染色質相關課題的優選方法。