生化實驗講義(理論部分)——層析技術（一）

  通過生物化學實驗應該做到：
    ⑴ 學習設計一個實驗的基本思路，掌握各個實驗的基本原理，學會嚴密地組織自己的實驗，合理地安排實驗步驟和時間。
    ⑵ 訓練實驗的動手能力，學會熟練地使用各種生物化學實驗儀器，包括各種天平、各種分光光度計、各種離心機、自動部分收集器、恒流泵、核酸蛋白檢測儀、冰凍干燥機、酸度計、電導率儀、高速分散器、各種電泳裝置和搖床等等。
    ⑶ 學會準確翔實地記錄實驗現象和數據的技能，提高實驗報告的寫作能力，能夠整齊清潔地進行所有的實驗，培養嚴謹細致的科學作風。
    ⑷ 掌握生物化學的各種基本實驗方法和實驗技術，尤其是各種電泳技術和層析枝術，為今后參加科研工作打下堅實的基礎。
1.1 生物化學實驗技術發展簡史
      生物科學在20世紀有驚人的發展，其中生物化學與分子生物學的進展尤為迅速，這樣一門最具活力和生氣的實驗科學，在21世紀必將成為帶頭的學科，這主要有賴于生物化學與分子生物學實驗技術的不斷發展和完善。這里我們簡單回顧一下生物化學實驗技術的發展歷史。
      20年代： 微量分析技術導致了維生素、激素和輔酶等的發現。瑞典著名的化學家T.Svedberg奠基了“超離心技術”，1924年制成了第一臺5000×g（5000 r/min～8000 r/min）相對離心力的超離心機(相對離心力“RCF”的單位可表示為“×g”)，開創了生化物質離心分離的先河，并準確測定了血紅蛋白等復雜蛋白質的分子量，獲得了1926年的諾貝爾化學獎。
      30年代： 電子顯微鏡技術打開了微觀世界，使我們能夠看到細胞內的結構和生物大分子的內部結構。
      40年代： 層析技術大發展，兩位英國科學家Martin和Synge發明了分配色譜（層析），他們獲得了1952年的諾貝爾化學獎。由此，層析技術成為分離生化物質的關鍵技術。
    “電泳技術”是由瑞典的著名科學家Tisellius所奠基，從而開創了電泳技術的新時代，他因此獲得了1948年的諾貝爾化學獎。
      50年代： 自1935年Schoenheimer和Rittenberg首次將放射性同位素示蹤用于碳水化合物及類脂物質的中間代謝的研究以后，“放射性同位素示蹤技術”在50年代有了大的發展，為各種生物化學代謝過程的闡明起了決定性的作用。
      60年代： 各種儀器分析方法用于生物化學研究，取得了很大的發展，如HPLC技術、紅外、紫外、圓二色等光譜技術、NMR核磁共振技術等。自1958年Stem，Moore和Spackman設計出氨基酸自動分析儀，大大加快了蛋白質的分析工作。      1967年Edman和Begg制成了多肽氨基酸序列分析儀，到1973年Moore和Stein設計出氨基酸序列自動測定儀，又大大加快了對多肽一級結構的測定，十多年間氨基酸的自動測定工作得到了很大的發展和完善。
      1962年，美國科學家Watson和英國科學家Crick因為在1953年提出的DNA分子反向平行雙螺旋模型而與英國科學家Wilkins分享了當年的諾貝爾生理醫學獎，后者通過對DNA分子的X-射線衍射研究證實了Watson和Crick的DNA模型，他們的研究成果開創了生物科學的歷史新紀元。在X-射線衍射技術方面，英國物理學家Perutz對血紅蛋白的結構進行X-射線結構分析, Kendrew測定了肌紅蛋白的結構，成為研究生物大分子空間立體結構的先驅，他們同獲1962年諾貝爾化學獎。
      此外，在60年代，層析和電泳技術又有了重大的進展，在1968—1972年Anfinsen創建了親和層析技術，開辟了層析技術的新領域。1969年Weber應用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術測定了蛋白質的分子量，使電泳技術取得了重大進展。
      70年代： 基因工程技術取得了突破性的進展，Arber，Smith和Nathans三個小組發現并純化了限制性內切酶，1972年，美國斯坦福大學的Berg等人首次用限制性內切酶切割了DNA分子，并實現了DNA分子的重組。1973年，又由美國斯坦福大學的Cohen等人第一次完成了DNA重組體的轉化技術，這一年被定為基因工程的誕生年，Cohen成為基因工程的創始人，從此，生物化學進入了一個新的大發展時期。與此同時，各種儀器分析手段進一步發展，制成了DNA序列測定儀、DNA合成儀等。
      80至90年代： 基因工程技術進入輝煌發展的時期，1980年，英國劍橋大學的生物化學家Sanger和美國哈佛大學的Gilbert分別設計出兩種測定DNA分子內核苷酸序列的方法，而與Berg共獲諾貝爾化學獎，從此，DNA序列分析法成為生物化學與分子生物學最重要的研究手段之一。他們3人在DNA重組和RNA結構研究方面都作出了杰出的貢獻。
      1981年由Jorgenson和Lukacs首先提出的高效毛細管電泳技術（HPCE），由于其高效、快速、經濟，尤其適用于生物大分子的分析，因此受到生命科學、醫學和化學等學科的科學工作者的極大重視，發展極為迅速，是生化實驗技術和儀器分析領域的重大突破，意義深遠。現今，由于HPCE技術的異軍突起，HPLC技術的發展重點己轉到制備和下游技術。
      1984年德國科學家Kohler、美國科學家Milstein和丹麥科學家Jerne由于發展了單克隆抗體技術，完善了極微量蛋白質的檢測技術而共享了諾貝爾生理醫學獎。
      1985年美國加利福尼亞州Cetus公司的Mullis等發明了PCR技術（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶鏈式反應的DNA擴增技術，對于生物化學和分子生物學的研究工作具有劃時代的意義，因而與第一個設計基因定點突變的Smith共享1993年的諾貝爾化學獎。
      除上述歷史以外，還可以列出許多生物化學發展史上的重要成就，例如：
      美國哈佛大學的Folin教授和中國的吳憲教授對生物化學常用的各種分析方法（血糖分析、蛋白質含量分析、氨基酸測定等）的建立作出了歷史性的貢獻。
      美國化學家Pauling確認氫鍵在蛋白質結構中以及生物大分子間相互作用的重要性等，他獲得了諾貝爾化學獎。
      英藉德裔生物化學家Krebs，在1937年發現了三羧酸循環，對細胞代謝及分子生物學的研究作出了重要貢獻，他與美藉德裔生物化學家Lipmann共獲1953年諾貝爾生理醫學獎。
      英國生物化學家Sanger還于1953年確定了牛胰島素中氨基酸的精確順序而獲得1958年的諾貝爾化學獎。
      1959年，美藉西班牙裔科學家Uchoa發現了細菌的多核苷酸磷酸化酶，研究并重建了將基因內的遺傳信息通過RNA中間體翻譯成蛋白質的過程。他和Kornberg分享了當年的諾貝爾生理醫學獎，而后者的主要貢獻在于實現了DNA分子在細菌細胞和試管內的復制。
      美國生物化學家Nirenberg在破譯遺傳密碼方面作出了重要貢獻，Holly闡明了酵母丙氨酸tRNA的核苷酸排列順序，后來證明所有tRNA的結構均相似。美藉印度裔生物化學家Khorana曾合成了精確結構的己知核酸分子，并首次人工制成酵母基因。他們3人共獲1969年諾貝爾生理醫學獎。
      法國生物學家Lwoff、JAcob和生物化學家Monod由于在病毒DNA和mRNA等方面出色的大量研究工作而共獲1965年諾貝爾生理醫學獎。
      1988年，美國遺傳學家McClintock由于在二十世紀五十年代提出并發現了可移動的遺傳因子而獲得諾貝爾生理醫學獎。
      1989年，美國科學家Altman和Cech由于發現某些RNA具有酶的功能（稱為核酶）而共享諾貝爾化學獎。
      1993年，美國科學家Roberts和Sharp由于在斷裂基因方面的工作而榮獲諾貝爾生理醫學獎。
      1994年，美國科學家Gilman和Rodbell由于發現了G蛋白在細胞內信息傳導中的作用而分享諾貝爾生理醫學獎。
      1995年，美國科學家Lewis、德國科學家Nusslein-Volhard和美國科學家Wieschaus由于在20世紀40～70年代先后獨立鑒定了控制果蠅體節發育基因而共享諾貝爾生理醫學獎。

      我國生物化學界的先驅吳憲教授在20年代初由美回國后，在協和醫科大學生化系與汪猷、張昌穎等人一道完成了蛋白質變性理論、血液生化檢測和免疫化學等一系列有重大影響的研究。1965年我國化學和生物化學家用化學方法在世界上首次人工合成了具有生物活性的結晶牛胰島素，1983年又通過大協作完成了酵母丙氨酸轉移核糖核酸的人工合成。近年來，在酶學研究、蛋白質結構及生物膜的結構與功能等方面都有舉世矚目的研究成果。
      由近百年來生物化學及其實驗技術的發展史可以看出，該學科的發展與實驗技術的發展密切相關，每一種新的生化物質的發現與研究都離不開實驗技術，實驗技術每一次新的發明都大大推動了生物化學研究的進展，因而對于每一位現代生物科學工作者，尤其是生物化學工作者，學習并掌握各種生物化學實驗技術就是極為重要的。