毒理學新技術以及發展方向介紹（一）

  毒理學是一門研究化學物質對生物體的毒性反應、嚴重程度、發生頻率和毒性作用機制的科學，也是對毒性作用進行定性和定量評價的科學。毒理學與藥理學密切相關，目前已發展成為具有一定基礎理論和實驗手段的獨立學科，并逐漸形成了一些新的毒理學分支。本文就新技術在分子毒理學中的應用及毒理學的一些發展趨勢作一簡述。
1　基因引入技術在毒理學中的應用
    分子毒理學研究是采用分子生物學技術和方法來研究毒理學問題。如體外采用細胞培養等檢測基因毒性，整體動物試驗采用轉基因動物模型，這對于闡明外源性化學物的毒性及其機制均有重要意義。
    基因引入技術是把一段DNA(可以是一個完整的基因，也可以是一個基因片段)引入到細胞或生物體內。引入的DNA可以改變毒物的作用強度，或改變毒物作用方式。因此，可以通過毒物作用程度或方式的改變來判斷引入的DNA所起的毒性作用。
1.1　在致突變檢測中的應用
    基因毒物是指能損害遺傳物質DNA的化學物，大多為致突變劑。常規的Ames試驗是由細菌介導的檢測基因毒物的方法。但這種方法也有一定的局限性，有時可出現假陽性結果。如谷胱甘肽和半胱氨酸均為抗癌劑，但在Ames試驗中卻顯示較強的致突變能力。此外，細菌和動物細胞在其生物學方面有很大差異，因此體外動物細胞實驗較細菌更能反映毒物在機體內的作用。有兩類細胞常用于基因毒物的檢測，一類為原代細胞，另一類為傳代細胞。有多種指標用于檢測化學物的基因毒性，如核苷酸同位素標記法，若一種化學物能損害DNA，細胞在用該化學物處理后，對損害的DNA要進行修復，修復過程需要核苷酸，如果在培養基中加入同位素標記的核苷酸，則修復的DNA即被同位素標記，在一定情況下，損害的DNA越多，修復的就越多，細胞DNA含的同位素就越多。因此，通過檢測DNA中同位素的含量來決定該化學物的基因毒性。另一種判斷方法是根據基因毒物能改變細胞的代謝。如正常的V79細胞具有次黃嘌呤磷酸轉移酶，這種酶是正常替代途徑中合成嘌呤核苷酸的必需酶。如果培養基中有嘌呤的同系物(如8-偶氮鳥嘌呤)，這種酶能將其同系物轉化成相應的嘌呤核苷酸而合成DNA，但嘌呤同系物沒有正常嘌呤功能，因此會導致細胞死亡。相反，如果一種化學物能損害DNA而使次黃嘌呤磷酸轉移酶的基因發生損害而不能合成正常的酶，其受損的細胞反而存活下來。存活的細胞越多，在一定情況下說明該化學物的致突變能力越強。
    某些化學物本身并沒有毒性，但其代謝物顯示出較強的毒性作用。對于這些化學物，上述方法不能檢測出它們的毒性。為了克服這一缺點，可在細胞或細菌培養液中加入肝細胞抽提液以幫助代謝毒物。有的實驗室還用少量原代細胞與被檢的傳代細胞混合培養，由引入的原代細胞提供代謝酶。如硝基二甲基胺，用常規的細菌檢測系統顯示不出任何突變作用，但在細菌培養液中加入肝細胞抽提液后，顯示出很強的基因毒性。這些實驗也存在許多問題，如有些代謝物的半衰期很短，來不及進入檢測細胞與其DNA作用就失活了，肝臟抽提液或原代細胞代謝酶活性隨時間下降得很快；肝臟抽提液或原代細胞含多種酶，即使能代謝毒物并顯示出毒性，也不知道是哪種酶起主導作用。很顯然，建立一種細胞株，能合成某種單一的酶，對研究毒物的毒性作用很重要。利用分子生物學技術，把轉錄某種代謝酶的DNA連接，再接到基因載體上(多為質粒或病毒)，這段具有調控能力的DNA，能與體外培養細胞的轉錄因子作用，把含有編碼某種代謝酶的DNA的基因載體引入到體外培養細胞，該細胞就能表達這種特異的酶。這方面較突出的例子是細胞多功能性單胺氧化酶(P450)。體外建立能表達P450的細胞株有兩類，一類是能長期穩定表達的細胞株，一類是能短期表達的細胞株。人的多種P450，如1A1，2A6，2E1，3A4等，已成功地引入人的淋巴樣細胞株、鼠的胎盤細胞株、蒼鼠肝癌細胞株等，這些細胞株由于能表達毒物代謝酶，對需要代謝后才有毒性的化學物，其檢測敏感度提高許多倍。如表達2A6的細胞比不表達2A6的同樣細胞株，在檢測硝基二甲基胺的毒性方面要敏感500倍；比表達2E1的細胞也要敏感大約500倍。說明硝基二甲基胺要代謝以后才能顯示毒性，也說明2A6是能將硝基二甲基胺轉化為毒性代謝物的代謝酶，而2E1則不是。
1.2　轉基因動物在毒理學中的應用
    轉基因動物是在其基因組中含有外來遺傳物質的動物，它被廣泛應用于科學研究的各個方面。由于轉基因動物集整體、細胞和分子水平于一體，更能體現生命整體研究的效果，因此成為毒理學研究的熱點之一。
1.2.1　一般毒性研究模型
    C-fos-LacZ轉基因小鼠用于神經毒性的研究。金屬硫蛋白(MT)基因的轉基因和基因刪除小鼠用于金屬和某些非金屬的研究。如用MT轉基因小鼠對鎘等的抗性增加，而MT的基因刪除小鼠對鎘、銀、汞、順鉑和四氯化碳的毒性敏感性增強。
1.2.2　致突變檢測模型
    轉基因動物為解決遺傳毒性研究中長期存在的一些問題提供了可能性。如體外試驗和體內整體動物的定性、定量外推，整體動物基因突變需消耗大量動物和時間，如確定靶器官以及對誘發的遺傳改變做精細分析等。自Gosen等1989年建立了第一個轉基因突變檢測模型以來，已有十多種模型。
1.2.3　致癌檢測模型及其在致癌物質作用機制研究中的應用
    轉基因動物為快速檢測致癌物、促癌物和研究化學致癌的機制提供了新的重要途徑。目前已建立的檢測模型或研究模型有：①過量表達癌基因的轉基因動物模型　如TG，AC小鼠，HK-fos轉基因小鼠，ras-H2轉基因小鼠，攜帶激活的H-ras原癌基因小鼠等。這些轉基因動物對化學致癌劑的敏感性提高了許多倍。如帶有激活Pim-l腫瘤基因的轉基因動物，對乙基硝基脲的致癌作用，較相應的非轉基因動物，其敏感性提高了25倍；②基因刪除動物致癌檢測模型　用同源重組的方法，將一段DNA整合到抗腫瘤基因，使該抗腫瘤基因不能表達具有正常功能的蛋白質，用這種方法培養的動物稱基因刪除動物。在這方面研究得最多的是腫瘤抑制基因P53。基因刪除動物P53(+/-)和正常動物P53(+/+)一樣，發育和生長均無異常，但用致癌劑(如二硝基二甲胺)處理后，P53(+/-)基因刪除動物的平均壽命為29周，而P53(+/+)的平均壽命為42周，其腫瘤的發生與分布也有很大的差異。其他如芳香烴受體(AHR)小鼠、過氧化物酶體增殖劑誘導的受體α(PPARα)小鼠等；③轉基因動物用于生殖毒性研究　ZP3(編碼)透明帶硫酸糖蛋白基因刪除小鼠、雌激素受體基因或孕酮受體基因刪除小鼠、DNA甲基轉移酶基因刪除小鼠等。
1.2.4　用于特定組織毒性研究的轉基因動物
    典型的例子是用含乳糖操縱子的噬菌體培育一種轉基因動物，具有乳糖操縱子的噬菌體在感染某些細菌后，菌落為藍色。如果含有乳糖操縱子的噬菌體在體內由于受化學物的處理而受到損害， 不能抄錄正常的半乳糖苷水解酶，這種噬菌體在體外裝配后，其感染細菌的菌落為無色。因此根據藍色和無色菌落的多少，來判斷某些化學物基因毒性的強弱。此外，用質粒作為載體也獲成功，從而提高了檢測的敏感性，更重要的是，化學物處理后的動物，基因載體可以從不同組織細胞分離出來，因此這種動物能顯示化學物的組織細胞特異毒理學作用。