高速逆流色譜(High-speed Countercurrent Chromatography,簡稱HSCCC)是由美國國家醫學院Yiochiro Ito博士于1982年首先開始的。到目前為止,此項技術已用于生物化學、生物工程、醫學、藥學、天然產物化學、有機合成、化工、環境、農業、 食品、材料等領域。開展此項技術研究的科學家遍及美國、日本、中國、俄羅斯、法國、英國、瑞士等地。
高速逆流色譜具有兩大突出優點:
1.聚四氟乙烯管中的固定相不需要載體,因而消除了氣液色譜中由于使用載體而帶來的吸附現象,特別適用于分離極性物質和具有生物活性的物質。
2.由于其與一般色譜的分離方式不同,使其特別適用于制備性分離。最近的研究結果表明:一臺普通的高速逆流色譜儀一次進樣可達幾十毫升,一次可分離近10g的樣品。因此,在80年代后期被廣泛地應用于植物化學成分的分離制備研究,本文就其在這方面的成果作一綜述。
1 生物堿
生物堿是植物中一類重要的化學成分,在植物中分布非常廣泛,至少有50多科120屬以上的植物中已證明有生物堿存在,已知的生物堿種類也至少在2000種以上。到目前為止,用高速逆流色譜研究天然產物化學成分也以生物堿的研究報道得最多。
正丁醇:丙酮:水(8:1:10)曾用于從委內瑞拉的箭毒中分離馬枯素和Panarine,樣品進樣達700mg;正丁醇:氯化鈉(0.1mol/L)(1:1)的兩相溶劑體系用于從Strychnos usambarensis(馬錢科)的樹干和樹皮(3:7:5:5)在70min內以1800r/min的轉速從粉防已干根的提取物中分離了粉防己堿、去甲粉防己堿和輪環藤酚堿;從小蔓長春花植物的葉子中用正己烷:乙醇:水(6:5:5)體系分離長春胺和長春辛;分別用正己烷:乙酸乙脂:乙醇:水(6:3:2:5)和正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水(1:1:1:1)從紅豆杉的粗提物中分離純化了紫杉醇、cephalomannine、巴卡亭Ⅲ;以石油醚(bp.40~65℃):乙酸乙脂:甲醇:水(50:70:80:65)為兩相體系從紫杉醇的混合物中分離得到了純的紫杉醇和cephalomannine。
有學者對粉防己的粗提物也進行了分離;從苦參總堿中分離了苦參堿和氧化苦參堿,從洋金花總堿中分離了莨菪堿、東莨菪堿及待定成分;從峨眉千里光粗堿中分離了金緣千里光堿、闊葉千里光堿和新闊葉千里光堿;從三尖杉總堿中分離異三尖杉酯堿、高三尖杉酯堿和三尖杉酯堿。
氯仿:甲醇:水(5:4:3)體系曾用于感染了枝頂孢屬內部寄生菌的睡眠草,分離得到了麥角生物堿。Ito于1994年用新型的pH區帶提取CCC技術從Crinum moores的抽取物中進樣3g得到了3個純的生物堿,此技術是HSCCC的一個較大的突破,它使植物的分離提取每次很方便地就達到了克量級。
2 黃酮類似物
黃酮類似物是一類比較重要的植物化學成分,它包括黃酮、異黃酮、二氫黃酮、花色苷元、兒茶精和屬于黃酮異構體的橙酮,以及由它們所衍生的各式各樣的衍生物。
用氯仿:甲醇:水(4:3:2)體系曾從芫花總黃酮中一次進樣100mg分離得到了3'-羥基芫花素、洋芹素、木犀草素;從山楂葉粗提物中分離金絲桃苷、槲皮素、蘆丁、牡荊素、異牡荊素;以氯仿:甲醇:水(33:40:27)體系,700r/min轉速,在70min內從黃酮混合物中分離出橙皮素,四羥基黃酮和槲皮黃酮,并有效地利用了梯度洗脫技術;Vanhaelen等將HSCCC與
HPLC相結合從500mg的Ginkgo
biloba(銀杏屬)的葉子萃取物中一次分離出了7個黃酮苷,其以水為固定相,開始以乙酸乙酯為流動相,然后在流動相中逐漸添加異丁醇,到分離結束時乙酸乙酯與異丁醇之比為(6:4);Oka等以氯仿:甲醇:水(4:3:2)的體系在3500r/min下在8min內從See
buckthourn的果實萃取物中分離得到了5個主成分,其分離速度完全可與
HPLC相比較;還有學者也從大黃羥基蒽醌總苷元中分離了大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素、大黃素甲醚、大黃酚等;用正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水(9:1:5:5)在1800r/min轉速下在70min內從掌葉大黃的根莖中分離出大黃素甲醚、蘆薈大黃酸、大黃酸、大黃酚和大黃素;將Epilobium
parviflorum(柳葉菜屬)的甲醇萃取物進樣2g分離得到了槲皮苷、楊梅苷、異楊梅苷和沒食子酸,兩相系統為氯仿:甲醇:水(7:13:8)。
Chen1992年利用氯仿:甲醇:水(4:3:2)的兩相系統對5個黃酮類化合物進行了分離并進行了定量分析;Kapadia 1994年利用正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水(1:4:2.5:2.5)從Garcinia Kola(藤黃屬)種子中也分離出了多個雙黃酮。
3 萜類
萜類是具有(C5H8)n通式的天然化合物,以及含氧及飽和程度不等的衍生物。Wallach曾提出異戊二烯法則,根據分子中可分異戊二烯的多少分別稱為單萜、倍半萜、二萜、三萜等,植物中存在的橡膠、某些色素、揮發油、樹脂、苦味素等類型成分,大多屬于萜類或含有萜類成分。
有人從青蒿中純化出了Artemisinin,實驗以異辛烷:乙酸乙酯(7:3)為固定相,甲醇:水(6:4)作為流動相;以異辛烷:甲醇:水(10:7:3)為固定相和流動相從青蒿中分離了epideoxyarteannuin;利用四氯化碳:甲醇:水(5:4:1)的溶劑系統以800r/min的轉速,將Cochlospermum tinctorium(卷胚屬)的根的甲醇萃取物500mg溶解在10ml的1:1的兩相溶劑系統中一次進樣得到純的cochloxan-thin和dihydrocochloxanthin;以氯仿:甲醇:水(9:12:8)從龍膽的根的甲醇萃取物中分離得到了1個裂環烯醚萜苷,從Halenia campanulata中分離得到了2個裂環烯醚萜苷類;以氯仿:甲醇:水(7:13:8)從Abrus fruticulosus的葉中分離出了4個甜味萜苷;從非洲植物Sesamum alatum中分離出了18,19-secoursane clisaccharide,兩相系統為氯仿:甲醇:戊醇-2:水(5:6:1:4);用氯仿:甲醇:異丁醇:水(7:6:3:1)的系統從積雪草的抽提物中分離了2個結構非常相似的皂角苷,1個是積雪草苷、1個是madecassoside,它們僅在同一支鏈上前者是H,后者是OH。
4 木脂素
木脂素是一類由被子植物和裸子植物中分離出的植物成分,隱花植物中很少存在,它一般在木部和樹脂中存在得比較廣泛,所以稱為木脂素類。Marrston等1988年以1g的進樣較大范圍地分離制備了肉桂酸、阿魏酸和咖啡酸,采用的溶劑系統為正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水(3:7:5:5),轉速700r/min。
以正己烷:甲醇:水(6:5:5)的兩相系統以1500r/min的轉速在80min內曾從江花五味子果實的核的乙醇萃取物中分離了2個結構十分相似的木脂素的成分:schisanhend和它的乙酸化物;以氯仿:甲醇:水的溶劑系統從西伯利亞人參的根中分離得到了純的eleutheroside。
Nitao等于1991年主張用正己烷:乙腈:乙酸乙酯:水(8:7:5:1)的兩相系統從Magnolia virginian中進行neelignans的最初純化,它比傳統的柱色譜更快、更有效、更經濟。
5 香豆素類
香豆素及其衍生物廣泛分布于植物界。曾用氯仿:甲醇:水(13:23:16)的兩相系統一次進樣440mg來自于Lomatium dissectum的樣品得到了3個香豆素的苷和1個黃酮苷;用氯仿:甲醇:水(13:7:8)的兩相體系分離并分析了香豆素混合物中甲醚散形酮、7-甲氧(基)香豆素、7-羥基-6-甲氧基香豆素和7-羥基香豆素;俞維樂等1995年從Artemisia dalailamae kraschen中以氯仿:甲醇:水(2:1:1)分離出了純的7-羥基-6-甲氧基香豆素以及isofraxdin和taxaxeryl-acetate,達到了很好的分離效果。
6 其它
除了上述主要的五大類外,HSCCC在其它植物成分的分離中也有應用,如有學者以氯仿:甲的兩相系統,以800r/min的轉速從90mg的商品毛地黃皂苷中分離出了幾個強心苷的化合物;用HSCCC分離鞣酸;用正己烷:乙腈:叔丁基甲基醚(10:10:1)從香芹菜中分離falcarind和falcarindiel;還從香芹菜中分離得到了2個C20化合物。
7 結語
綜上所述,HSCCC在天然產物中的分離制備是很成功的。既可分離又可定量,進樣量可從毫克級到克級,進樣體積可從幾毫升到幾十毫升;不但適用于非極性化合物,而且適用于極性化合物的分離;它可用于天然產物粗提物的去除雜質,也可用于最后產物的精制,甚至直接從粗提物一步純化到達純品;當加快儀器轉速如1800r/min,其分離速度可與HPLC媲美,用于天然產物化學成分的分離始于1985年,到1988年、1989年達到一個高潮,發表了大量的文章,目前處于平穩發展階段。1994年HSCCC創始人Ito又發展了pH-zone-refining CCC,使HSCCC的進樣量又大大地前進了一步,能方便地分離克量級的樣品,使其更加有利于天然植物的分離制備。因此,我們可以說,HSCCC已為天然植物的分離制備開辟了一個十分廣闊的新天地。