固相萃取與固相微萃取

固相萃取(Solid Phase Extraction  SPE)就是利用固體吸附劑將液體樣品中的目標化合物吸附，與樣品的基體和干擾化合物分離，然后再用洗脫液洗脫或加熱解吸附，達到分離和富集目標化合物的目的。  

與液－液萃取相比固相萃取有很多優點：固相萃取不需要大量互不相溶的溶劑，處理過程中不會產生乳化現象，它采用高效﹑高選擇性的吸附劑（固定相），能顯著減少溶劑的用量，簡化樣品于處理過程，同時所需費用也有所減少。一般說來固相萃取所需時間為液－液萃取的1/2，費用為液－液萃取的1/5。其缺點是：目標化合物的回收率和精密度要低于液－液萃取。

一． 固相萃取的模式及原理

固相萃取實質上是一種液相色譜分離，其主要分離模式也與液相色譜相同，可分為正相（吸附劑極性大于洗脫液極性），反相（吸附劑極性小于洗脫液極性），離子交換和吸附。固相萃取所用的吸附劑也與液相色譜常用的固定相相同，只是在粒度上有所區別。

正相固相萃取所用的吸附劑都是極性的，用來萃取（保留）極性物質。在正相萃取時目標化合物如何保留在吸附劑上，取決于目標化合物的極性官能團與吸附劑表面的極性官能團之間相互作用，其中包括了氫鍵，π—π鍵相互作用，偶極－偶極相互作用和偶極－誘導偶極相互作用以及其他的極性－極性作用。正相固相萃取可以從非極性溶劑樣品中吸附極性化合物。

反相固相萃取所用的吸附劑通常是非極性的或極性較弱的，所萃取的目標化合物通常是中等極性到非極性化合物。目標化合物與吸附劑間的作用是疏水性相互作用，主要是非極性－非極性相互作用，是范德華力或色散力。

離子交換固相萃取所用的吸附劑是帶有電荷的離子交換樹脂，所萃取的目標化合物是帶有電荷的化合物，目標化合物與吸附劑之間的相互作用是靜電吸引力。

固相萃取中吸附劑（固定相）的選擇主要是根據目標化合物的性質和樣品基體（即樣品的溶劑）性質。目標化合物的極性與吸附劑的極性非常相似的時，可以得到目標化合物的最佳保留（最佳吸附）。兩者極性越相似，保留越好（即吸附越好），所以要盡量選擇與目標化合物極性相似的吸附劑。例如：萃取碳氫化合物（非極性）時，要采用反相固相萃取（此時是非極性吸附劑）。當目標化合物極性適中時，正﹑反相固相萃取都可使用。吸附劑的選擇還要受樣品的溶劑強度（即洗脫強度）的制約。

樣品溶劑的強度相對該吸附劑應該是較弱的，弱溶劑會增強目標化合物在吸附劑上的保留（吸附）。溶劑強度在正﹑反固相萃取中的順序是不同的（見圖3—13）。如果樣品溶劑的強度太強，目標化合物將得不到保留（吸附）或保留很弱。例如：樣品溶劑是正己烷時用反相固相萃取就不合適了，因為正己烷對反相固相萃取是強溶劑（見圖3—13），目標化合物將不會吸附在吸附劑上；當樣品溶劑是水時就可以用反相固相萃取，因為水對反相固相萃取是弱溶劑，不會影響目標化合物在吸附劑上的吸附。

固相萃取選擇分離模式和吸附劑時還要考慮以下幾點：

1.  目標化合物在極性或非極性溶劑中的溶解度，這主要涉及淋洗液的選擇。

2. 目標化合物有無可能離子化（可用調節pH 值實現離子化），從而決定是否采用離子交換固相萃取。

3. 目標化合物有無可能與吸附劑形成共價鍵，如形成共價鍵，在洗脫時可能會遇到麻煩。

4. 非目標化合物與目標化合物在吸附劑上吸附點上的競爭程度，這關系到目標化合物與干擾化合物是否能很好分離。

二． 固相萃取常用的吸附劑（固定相）

鑒于固相萃取實質上是一種液相色譜的分離，故原則上講，可作為液相色譜柱填料的材料都可用于固相萃取。但是，由于液相色譜的柱壓可以較高，要求柱效較高，故其填料的粒度要求較嚴格，過去常用10μm粒徑填料，現在高效柱多用5μ的m填料，甚至用了3μm的填料（隨著HPLC泵壓的提高，填料的粒徑在逐漸減小）。對填料的粒徑分布要求也很窄。固相萃取柱上所加壓一般都不大，分離目的只是把目標化合物與干擾化合物和基體分開即可，柱效要求一般不高，故作為固相萃取吸附劑的填料都較粗，一般在40μm即可用，粒徑分布要求也不嚴格，這樣可以大大降低固相萃取柱的成本。常用于固相萃取的吸附劑類型及用途參見表3—4。

三． 固相萃取的裝置及操作程序

最簡單的固相萃取裝置就是一根直徑為數毫米的小柱（圖3—14），小柱可以是玻璃的，也可以是聚丙稀﹑聚乙烯﹑聚四氟乙烯等塑料的，還可以是不銹鋼制成的。小柱下端有一孔徑為20μm的燒結篩板，用以支撐吸附劑。如自制固相萃取小柱沒有合適的燒結篩板時，也可以用填加玻璃棉來代替篩板，起到既能支撐固體吸附劑，又能讓液體流過的作用。在篩板上填裝一定量的吸附劑（100㎎~1000㎎，視需要而定），然后在吸附劑上再加一塊篩板，以防止加樣品時破壞柱床（沒有篩板時也可以用玻璃棉替代）。目前已有各種規格的﹑裝有各種吸附劑的固相萃取小柱出售，使用起來十分方便（圖3—15）。

固相萃取的一般操作程序如下：

1．活化吸附劑：在萃取樣品之前要用適當的溶劑淋洗固相萃取小柱，以使吸附劑保持濕潤，可以吸附目標化合物或干擾化合物。不同模式固相萃取小柱活化用溶劑不同：

（1）反相固相萃取所用的弱極性或非極性吸附劑，通常用水溶性有機溶劑，如甲醇淋洗，然后用水或緩沖溶液淋洗。也可以在用甲醇淋洗之前先用強溶劑（如己烷）淋洗，以消除吸附劑上吸附的雜質及其對目標化合物的干擾。

（2）正相固相萃取所用的極性吸附劑，通常用目標化合物所在的有機溶劑（樣品基體）進行淋洗。

（3）離子交換固相萃取所用的吸附劑，在用于非極性有機溶劑中的樣品時，可用樣品溶劑來淋洗；在用于極性溶劑中的樣品時，可用水溶性有機溶劑淋洗后，再用適當PH 值的﹑并含有一定有機溶劑和鹽的水溶液進行淋洗。

為了使固相萃取小柱中的吸附劑在活化后到樣品加入前能保持濕潤，應在活化處理后在吸附劑上面保持大約1ml活化處理用的溶劑。

2．上樣：將液態或溶解后的固態樣品倒入活化后的固相萃取小柱，然后利用抽真空（圖3—16），加壓（圖3—17）或離心（圖3—18）的方法使樣品進入吸附劑。  

3． 洗滌和洗脫：在樣品進入吸附劑，目標化合物被吸附后，可先用較弱的溶劑將弱保留干擾化合物洗掉，然后再用較強的溶劑將目標化合物洗脫下來，加以收集。淋洗和洗脫同前所述一樣，可采用抽真空，加壓或離心的方法使淋洗液或洗脫液流過吸附劑。
如果在選擇吸附劑時，選擇對目標化合物吸附很弱或不吸附，而對干擾化合物有較強吸附的吸附劑時，也可讓目標化合物先淋洗下來加以收集，而使干擾化合物保留（吸附）在吸附劑上，兩者得到分離。圖3—19給出了兩種方法的示意圖。在多數的情況下是使目標化合物保留在吸附劑上，最后用強溶劑洗脫，這樣更有利于樣品的凈化。圖3—20給出了固相萃取

所采用的一般程序示意圖。

為了方便固相萃取的使用，很多廠家除了生產各種規格和型號的固相萃取小柱之外，還研制開發了很多固相萃取的專用裝置，使固相萃取使用起來更加方便簡單。如Supelco公司提供了給單個固相萃取小柱加壓的單管處理塞（圖3—21），可方便的與固相萃取小柱配套使用。又如，為了能使多個固相萃取小柱同時進行抽真空，Supelco公司提供了12孔徑和24孔徑的真空多歧管裝置（圖3—22），可同時處理多個固相萃取小柱。我國中科院大連化學物理研究所，國家色譜研究分析中心也研制開發了真空固相萃取裝置。

四． 固相微萃取(Solid phase Micro-Extraction  SPME)

固相微萃取是在固相萃取基礎上發展起來的一種新的萃取分離技術，與液—液萃取和固相萃取相比，具有操作時間短，樣品量小，無需萃取溶劑，適于分析揮發性與非揮發性物質，重現性好等優點。很多研究結果表明，在樣品中加入適當的內標進行定量分析時，其重現性和精密度都非常好。固相微萃取裝置外型如一只微量進樣器，由手柄（holder）和萃取頭或纖維頭（fiber）兩部分構成，萃取頭是一根1㎝長，涂有不同吸附劑的熔融纖維，接在不銹鋼絲上，外套細不銹鋼管（保護石英纖維不被折斷），纖維頭在鋼管內可伸縮或進出，細不銹鋼管可穿透橡膠或塑料墊片進行取樣或進樣。手柄用于安裝或固定萃取頭，可永遠使用（圖3—24）

固相微萃取關鍵在于選擇不石英纖維上的涂層（吸附劑），要使目標化合物能吸附在涂層上，而干擾化合物和溶劑不吸附，一般是：目標化合物是非極性時選擇非極性涂層；目標化合物是極性時選擇極性涂層。
固相微萃取的采樣方法是將固相微萃取針管（不銹鋼套管）穿過樣品瓶密封墊，插入樣品瓶中。然后推出萃取頭，將萃取頭浸入樣品（浸入方式）或置于樣品上部空間（頂空方式），進行萃取。萃取時間大約2—30分鐘，以達到目標化合物吸附平衡為準。最后縮回萃取頭，將針管拔出（圖3—25）。

固相微萃取可用于氣相色譜，也可用于液相色譜（圖3—25）。用于GC時，是將固相微萃取針管（不銹鋼套管）插入GC進樣口，推手柄桿，伸出纖維頭，使用進樣口的高溫熱解吸目標化合物，解吸后被載氣帶入色譜柱。用于HPLC時，是將固相微萃取針管（不銹鋼套管）插入固相微萃取/HPLC接口解吸池，然后再利用HPLC的流動相通過解吸池洗脫目標化合物，并將目標化合物帶入色譜柱。

五． 固相萃取的應用

固相萃取主要用于復雜樣品中微量或痕量目標化合物的分離和富集。例如，生物體液（如血液，尿等）中藥物及其代謝產物的分析，食品中有效成分或有害成分的分析，環保水樣中各種污染物（可揮發性有機物和半揮發性有機物）的分析都可使用固相萃取將目標化合物分離出來，并加以富集，然后進行色譜分析。下面舉兩個具體分析實例加以說明。

1． 血漿中苯并二氮雜草類藥物（安定）的測定

使用6ml的固相萃取柱，柱內填加500㎎C18吸附劑。用5ml甲醇活化，然后再用5ml水淋洗。將1ml 0.1M醋酸鈉加入4ml血漿中，充分混合后倒入萃取柱內，抽濾。然后加入3ml水，抽濾30秒。再將固相萃取柱在1000~1500rpm離心機上離心5分鐘。用3ml丙酮洗脫，收集洗脫液，將洗脫液在氮氣流下緩緩加熱（<45℃）至干燥。用200μl甲醇溶解殘渣，進樣20μl，進行HPLC分析。

HPLC條件：

柱子: ODS-3   5μm  150×4.6mm

流動相:乙腈/甲醇/5mMKH2PO4(15/30/55）

流速: 2ml/min

柱溫: 40℃

檢測器: UV254

2． 水中多環芳烴（PAHS）的測定

使用6ml固相萃取柱，柱內填加500mgC18吸附劑，用5ml二氯甲烷活化, 然后再用5ml甲醇和5ml水重復一次。加2ml異丙醇到20ml水樣中（10%異丙醇含量）， 混合后倒入固相萃取柱，流速不得大于10ml/min。用3ml甲醇/水（50/50）淋洗，抽真空30秒，再將固相萃取柱在1000~1500rpm離心機上離心5分鐘。用3ml二氯甲烷洗脫，收集洗脫液。將洗脫液在干燥氮氣流下濃縮到50~200μl，濃縮時樣品不要加熱，以免造成小分子多環芳烴的丟失。加二氯甲烷至總體積為200μl，進樣20μl，進行GC分析。

GC條件： 柱DB-5   30m×0.25mmID  0.25μ    載氣：氮氣  線速度為35cm/秒 (65℃)

程序升溫：65℃停留1分鐘后以25℃/分的升溫速率升至140℃，然后以10℃/分的升溫速

率升至290℃，在290℃停留25分鐘。進樣：275℃  不分流進樣，吹掃45秒

檢測器：FID  300℃   尾吹氮氣30ml/分     實驗結果見圖3—27和表3—6