(2)分離度 定量分析時,為便于準確測量,要求定量峰與其他峰或內標峰之間有較好的分離度。分離度(R)的計算公式為:
式中tR2為相鄰兩峰中后一峰的保留時間;
tR1為相鄰兩峰中前一峰的保留時間;
W1及W2為此相鄰兩峰的峰寬。
除另有規定外,分離度應大于1.5。
(3)重復性 取各品種項下的對照溶液,連續進樣3~5次,除另有規定外,其峰面積測量值的相對標準偏差應不大于2.0%。也可按各品種校正因子測定項下,配制相當于80%、100%和120%的對照品溶液,加入規定量的內標溶液,配成3種不同濃度的溶液,分別進樣3次,計算平均校正因子。其相對標準偏差也應不大于2.0%。
(4)拖尾因子 為保證測量精度,應檢查待測峰的拖尾因子(T)是否符合各品種項下的規定,或不同濃度進樣的校正因子誤差是否符合要求。拖尾因子計算公式為:
式中 W0.05h為0.05峰高處的峰寬;
d1為峰極大至峰前沿之間的距離。
除另有規定外,峰高法定量時T應在0.95~1.05之間。
3.測定法
定量測定時,可根據供試品的具體情況采用峰面積法或峰高法。但測定雜質含量時,須采用峰面積法。
(1)內標法加校正因子測定供試品中某個雜質或主成分含量
按各品種項下的規定,精密稱(量)取對照品和內標物質,分別配成溶液,精密量取各溶液,配成校正因子測定用的對照溶液。取一定量注入儀器,記錄色譜圖。測量對照品和內標物質的峰面積或峰高,按下式計算校正因子:
校正因子
式中AS為內標物質的峰面積或峰高;
AR為對照品的峰面積或峰高;
CS為內標物質的濃度;
CR為對照品的濃度。
再取各品種項下含有內標物質的供試品溶液,注入儀器,記錄色譜圖,測量供試品(或其雜質)峰和內標物質的峰面積或峰高,按下式計算含量:
含量
式中AX 為供試品(或其雜質)峰面積或峰高;
CX 為供試品(或其雜質)的濃度;
A′S 為供試品溶液中內標物質的峰面積或峰高;
C′S 為供試品溶液中內標物質的濃度;
f 為校正因子。
當配制校正因子測定用的對照溶液和含有內標物質的供試品溶液使用同一份內標物質溶液時,CS=C′S,則配制內標物質溶液不必精密稱(量)取。
(2)外標法測定供試品中某個雜質或主成分含量
按各品種項下的規定,精密稱(量)取對照品和供試品,配制成溶液,分別精密取一定量,注入儀器,記錄色譜圖,測量對照品和供試品待測成分的峰面積(或峰高),按下式計算含量:
含量
式中各符號意義同上。由于微量注射器不易精確控制進樣量,當采用外標法測定供試品中某雜質或主成分含量時,以定量環或自動進樣器進樣為好。
(3)加校正因子的主成分自身對照法
測定雜質含量時,可采用加校正因子的主成分自身對照法。在建立方法時,按各品種項下的規定,精密稱(量)取雜質對照品和待測成分對照品各適量,配制測定雜質校正因子的溶液,進樣,記錄色譜圖,按上述(1)法計算雜質的校正因子。此校正因子可直接載入各品種正文中,用于校正雜質的實測面積。這些需作校正計算的雜質,通常以主成分為參照采用相對保留時間定位,其數值一并載入各品種正文中。
測定雜質含量時,按各品種項下規定的雜質限度,將供試品稀釋成與雜質限度相當的溶液作為對照溶液,進樣,調節檢測靈敏度(以噪聲水平可接受為限)或進樣量(以柱子不過載為限),使對照溶液中的主成分色譜峰高約達滿量程的10%~25%或其峰面積能準確積分(通常含量低于0.5%的雜質,峰面積的RSD應小于10%;含量在0.5%~2%的雜質,峰面積的RSD應小于5%;含量大于2%的雜質,峰面積的RSD應小于2%)。然后,取供試品溶液和對照品溶液適量,分別進樣,供試品溶液的記錄時間,除另有規定外,應為主成分保留時間的2倍,測量供試品溶液色譜圖上各雜質的峰面積,分別乘以相應的校正因子后與對照溶液主成分的峰面積比較,依法計算各雜質含量。
(4)不加校正因子的主成分自身對照法
當沒有雜質對照品時,可采用不加校正因子的主成分自身對照法。同上述(3)法配制對照溶液并調節檢測靈敏度后,取供試品溶液和對照溶液適量,分別進樣,前者的記錄時間,除另有規定外,應為主成分保留時間的2倍,測量供試品溶液色譜圖上各雜質的峰面積并與對照溶液主成分的峰面積比較,計算雜質含量。
若供試品所含的部分雜質未與溶劑峰完全分離,則按規定先記錄供試品溶液的色譜圖Ⅰ,再記錄等體積純溶劑的色譜圖Ⅱ。色譜圖Ⅰ上雜質峰的總面積(包括溶劑峰),減去色譜圖Ⅱ上的溶劑峰面積,即為總雜質峰的校正面積。然后依法計算。
(5)面積歸一化法
由于峰面積歸一化法測定誤差大,因此,本法通常只能用于粗略考察供試品中的雜質含量。除另有規定外,一般不宜用于微量雜質的檢查。方法是測量個雜質峰的面積和色譜圖上除溶劑峰以外的總色譜峰面積,計算各雜質峰面積及其之和占總峰面積的百分率。