凝膠層析法(gel
chromatography)也稱分子篩層析法，是指混合物隨流動相經過凝膠層析柱時，其中各組分按其分子大小不同而被分離的技術。該法設備簡單、操作方便、重復性好、樣品回收率高，除常用于分離純化蛋白質、核酸、多糖、激素等物質外，還可用于測定蛋白質的相對分子質量，以及樣品的脫鹽和濃縮等。由于整個層析過程中一般不變換洗脫液，有如過濾一樣，故又稱凝膠過濾。
(一) 基本原理
凝膠是一種不帶電荷的具有三維空間的多孔網狀結構、呈珠狀顆粒的物質，每個顆粒的細微結構及篩孔的直徑均勻一致，象篩子，直徑大于孔徑的分子將不能迸入凝膠內部，便直接沿凝膠顆粒的間隙流出，稱為全排出。較小的分子在容納它的空隙內，自由出入，造成在柱內保留時間長。這樣，較大的分子先被洗脫下來，而較小的分子后被洗脫下來，從而達到相互分離的目的。洗脫時峰的位置和該物質相對分子質量有直接的定量關系。在一根凝膠柱中，顆粒間自由空間所含溶液的體積為外水體積V。不能進入凝膠孔徑的那些大分子，當洗脫體積為V。時，出現洗脫峰。凝膠顆粒內部孔穴的總體積稱為內水體積Vi
，能全部滲入凝膠的那些小分子，當洗脫體積為V。+ Vi 時出現洗脫峰。
（二）凝膠的類型及性質
層析用時凝膠都是三維空間的網狀高聚物，有一定的孔徑和交聯度。它們不溶于水，但在水中有較大的膨脹度，具有良好的分子篩功能。它們可分離的分子大小的范圍廣，相對分子質量在102～108范圍之間。在柱層析分離中常用的凝膠 有以下幾類:
交聯葡聚糖凝膠
交聯葡聚糖凝膠的商品名稱為Sephadex，由葡聚糖和3-氯-1.2-環氧丙烷(交聯劑)以醚鍵相互交聯而形成具有三維空間多孔網狀結構的高分子化合物。交聯葡聚糖凝膠，按其交聯度大小分成8種型號(表6–2)。交聯度越大，網狀結構越緊密，孔徑越小，吸水膨脹就愈小，故只能分離相對分子質量較小的物質；而交聯度越小，孔徑就越大，吸水膨脹大，則可分離相對分子質量較大的物質。各種型號是以其吸水量(每g干膠所吸收的水的質量)的10倍命名，如，Sephadex
G–25表示該凝膠的吸水量為每g干膠能吸2.5克水。在SephadexG–25及G–50中分別引入羥丙基基團，即可構成LH型烷基化葡聚糖凝膠。
交聯葡聚糖凝膠在水溶液、鹽溶液、堿溶液、弱酸溶液和有機溶劑中較穩定，但當暴露于強酸或氧化劑溶液中，則易使糖甘鍵水解斷裂。在中性條件下，交聯葡聚糖凝膠懸浮液能耐高溫，用120℃消毒10分鐘而不改變其性質。如要在室溫下長期保存，應加入適量防腐劑，如氯仿、疊氮鈉等，以免微生物生長。
交聯葡聚糖凝膠由于有羧基基團，故能與分離物質中的電荷基團(如堿性蛋白質)發生吸附作用，但可借助提高洗脫液的離子強度得以克服。因此在進行凝膠層析時，常用含有NaCl的緩沖溶液作洗脫液。交聯葡聚糖凝膠可用于分離蛋白質、核酸、酶、多糖、多肽、氨基酸、抗菌素，也可用于高分子物質樣品的脫鹽及測定蛋白質的相對分子質量。
2.瓊脂糖凝膠
瓊脂糖的商品名稱有Sepharose(瑞典)、Bio-gelA(美國)、Segavac(英國)、Gelarose(丹麥)等多種，因生產廠家不同名稱各異。瓊脂糖是由D-半乳糖和3，6位脫水的L-半乳糖連接構成的多糖鏈，在溫度10O℃時呈液態，當下降至45℃以下時，它們之間相互連接成線性雙鏈單環的瓊脂糖；再凝聚即呈瓊脂糖凝膠。商品除Segavac外，都制備成珠狀瓊脂糖凝膠。瓊脂糖凝膠按其濃度不同，分為Sepharose
2B(濃度為2％)、4B(濃度為4％)及6B(濃度為6％)。Sepharose與1，3-二溴異丙醇在強堿條件下反應，即生成CL型交聯瓊脂糖，其熱穩定性和化學穩定性均有所提高，可在廣泛pH溶液(pH3～14)中使用。通常的Sepharose只能在pH4.5～9.0范圍內使用。瓊脂糖凝膠在干燥狀態下保存易破裂，故一般均存放在含防腐劑的水溶液中。
瓊脂糖凝膠的機械強度和篩孔的穩定性均優于交聯葡聚糖凝膠。瓊脂糖凝膠用于柱層析時，流速較快，因此是一種很好的凝膠層析載體。
3.聚丙烯酰胺凝膠
它是由丙烯酚胺與交聯劑甲撐雙丙烯酚胺交聯聚合而成。改變單體(丙烯酚胺)的濃度，即可獲得不同吸水率的產物。聚丙烯酚胺凝膠的商品名稱為Bio-gel
P。該凝膠多制成干性珠狀顆粒劑型，使用前必須溶脹。聚丙烯酰胺凝膠的穩定性不如交聯葡聚糖凝膠，在酸性條件下，其酚胺鍵易水解為羧基，使凝膠帶有一定的離子交換基團，一般在pH4～9范圍內使用。實踐證明，聚丙烯酰胺凝膠層析對蛋白質相對分子質量的測定、核苷及核苷酸的分離純化，均能獲得理想的結果。
4.柱層析凝膠的選擇
在進行凝膠層析分離樣品時，對凝膠的選擇是必須考慮的重要方面。一般在選擇使用凝膠時應注意以下問題:
(1)混合物的分離程度主要決定于凝膠顆粒內部微孔的孔徑和混合物相對分子質量的分布范圍。和凝膠孔徑有直接關系的是凝膠的交聯度。凝膠孔徑決定了被排阻物質相對分子質量的下限。移動緩慢的小分子物質，在低交聯度的凝膠上不易分離，大分子物質同小分子物質的分離宜用高交聯度的凝膠。例如欲除去蛋白質溶液中的鹽類時，可選用SephadexG-25。
(2)凝膠的顆粒粗細與分離效果有直接關系。一般來說，細顆粒分離效果好，但流速慢；而粗顆粒流速快，但會使區帶擴散，使洗脫峰變平而寬。因此，如用細顆粒凝膠宜用大直徑的層析柱，用粗顆粒時用小直徑的層析柱。在實際操作中，要根據工作需要，選擇適當的顆粒大小并調整流速。
(3)選擇合適的凝膠種類以后，再根據層析柱的體積和干膠的溶脹度，計算出所需干膠的用量，其計算公式如下:
干膠用量/g＝πr2h/溶脹度(床體積/g干膠)。
考慮到凝膠在處理過程中會有部分損失，用上式計算得出的干膠用量應再增加10%-20%。
(三)操作要點
凝膠處理
交聯葡聚糖及聚丙烯酰胺凝膠的市售商品多為干燥顆粒，使用前必須充分溶脹。方法是將欲使用的干凝膠緩慢地傾倒入5～10倍的去離子水中，參照表6–2及其他相關資料中凝膠溶脹所需時間，進行充分浸泡，然后用傾倒法除去表面懸浮的小顆粒，并減壓抽氣排除凝膠懸液中的氣泡，準備裝柱。在許多情況下，也可采用加熱煮沸方法進行凝膠溶脹，此法不僅能加快溶脹速率，而且能除去凝膠中污染的細菌，同時排除氣泡。
2．凝膠柱制備
合理選擇層析柱的長度和直徑，是保證分離效果的重要環節。理想的層析柱的直徑與長度之比一般為1:25～1:100。凝膠柱的裝填方法和要求，基本上與離子交換柱的制備相同。一根理想的凝膠柱要求柱中的填料(凝膠)密度均勻一致，沒有空隙和氣泡。通常新裝的凝膠柱用適當的緩沖溶液平衡后，將帶色的蘭葡聚糖–2000、細胞色素，或血紅蛋白等物質配制成質量濃度為2g/L的溶液過柱，觀察色帶是否均勻下移，以鑒定新裝柱的技術質量是否合格，否則，必須重新裝填。
3．加樣與洗脫
(1)加樣量
加樣量與測定方法和層析柱大小有關。如果檢測方法靈敏度高或柱床體積小，加樣量可小；否則，加樣量增大。例如利用凝膠層析分離蛋白質時，若采用28Onm波長測定吸光度，對一根2cm×6Ocm的柱來說，加樣量需5mg左右。一般來說，加樣量越少或加樣體積越小(樣品濃度高)，分辨率越高。通常樣品液的加入量應掌握在凝膠床總體積的5％～
10％。樣品體積過大，分離效果不好。
對高分辨率的分子篩層析，樣品溶液的體積主要由內水體積(Vi)所決定，故高吸水量凝膠如Sephadex
G-200，每mL總床體積可加0.3～0.5mg溶質，使用體積約為0.O2倍總體積；而低吸水量凝膠如Sephadex
G–75，每mL總床體積加溶質質量為0.2mg，樣品體積為0.Ol倍總體積。
(2)加樣方法 如同離子交換柱層析一樣，凝膠床經平衡后，吸去上層液體，待平衡液下降至床表面時，關閉流出口，用滴管加入樣品液，打開流出口，使樣品液緩慢滲入凝膠床內。當樣品液面恰與凝膠床表面持平時，小心加入數mL洗脫液沖洗管壁。然后繼續用大量洗脫液洗脫。
(3)洗脫 加完樣品后，將層析床與洗脫液儲瓶、檢測儀、分部收集器及記錄儀相連，根據被分離物質的性質，預先估計好一個適宜的流速，定量地分部收集流出液，每組分一至數mL。各組分可用適當的方法進行定性或定量分析。
凝膠柱層析一般都以單一緩沖溶液或鹽溶液作為洗脫液，有時甚至可用蒸餾水。洗脫時用于流速控制的裝置最好的是恒流泵。若無此裝置，可用控制操作壓的辦法進行。
4.凝膠的再生和保存
凝膠層析的載體不會與被分離的物質發生任何作用，因此凝膠柱在層析分離后稍加平衡即可進行下一次的分析操作。但使用多次后，由于床體積變小，流動速率降低或雜質污染等原因，使分離效果受到影響。此時對凝膠柱需進行再生處理，其方法是:先用水反復進行逆向沖洗，再用緩沖溶液平衡，即可進行下一次分析。
對使用過的凝膠，若要短時間保存，只要反復洗滌除去蛋白質等雜質，加入適量的防腐劑即可；若要長期保存，則需將凝膠從柱中取出，進行洗滌、脫水和干燥等處理后，裝瓶保存之。