GeneCopoeia基因克隆技術相關研究

與PCR、qPCR等技術一樣，作為分子實驗室必備手段，分子克隆技術被廣泛用于多樣的基因功能研究。所謂分子克隆指的是在體外將核酸分子插入病毒、質粒或其他載體分子，構成遺傳物質的新組合，使之進入宿主細胞內并獲得持續穩定增殖能力和表達。

基因克隆技術的發展經歷3個階段，第一階段為經典的T4 DNA連接酶介導的TA克隆及粘性末端克隆，第二階段為基于DNA修飾酶的LIC系列克隆，第三階段為基于DNA重組酶的Gateway克隆及一步法克隆。

基于T4 DNA連接酶的克隆

本系列克隆使用的酶類為：T4 DNA連接酶。

限制性內切酶：可以對目的片段和載體識別并切割出相同的粘性末端，用于堿基互補配對。

T4 DNA連接酶：可以催化目的片段和載體最后一位堿基上的5’磷酸基團和3’羥基形成磷酸二酯鍵，以實現將目的片段和載體連接成環狀質粒。

根據是否使用限制性內切酶，可分為平末端克隆/TA克隆和粘性末端克隆。

基于DNA修飾酶的克隆方法

本系列克隆使用的酶類為：T4 DNA聚合酶

T4 DNA聚合酶具有3'→5'核酸外切酶活性和5'→3' DNA聚合酶活性。缺乏dNTP時，表現為3'→5'核酸外切酶活性，切割目的基因和載體，產生單鏈的DNA粘性末端；加入某一單獨dNTP，3'→5'核酸外切酶活性和5'→3' DNA聚合酶活性平衡，摻入與切割動態平衡，切割終止。因此，T4 DNA聚合酶為基礎的克隆方法的關鍵是目的基因和載體間需要有一定數量的重疊序列。

基于重組酶的克隆方法

Gateway克隆法——本系列克隆使用的酶類為：λ整合酶Int、λ切除酶Xis、大腸桿菌IHF因子。

該技術需要四個特異性重組位點（attB、aatP、attL、attR），引導發生兩個特異性重組反應（BP反應和LR反應）。BP反應：將目的基因克隆進入入門質粒。使用到的酶為Int和IHF。LR反應：將入門質粒中的目的基因轉移到終載體中，獲得表達載體。使用到的酶為Int、IHF及Xis。表達載體若帶有attR位點，則帶有attL位點的入門克隆便可以與之發生LR反應，進而將入門克隆的目的基因轉移到不同類型的表達載體中。

通過以上方法克隆的基因只有通過表達才能探索和研究基因的功能以及基因表達調控的機理，克隆基因表達出所編碼的蛋白質可供作結構與功能的研究。有些具有特定生物活性的蛋白質在醫學上、以至在工業上都是很有應用價值的，可以克隆其基因使之在宿主細胞中大量表達而獲得。而要使克隆基因在宿主細胞中表達，就要將它放入帶有基因表達所需要的各種元件的載體中，形成表達克隆。此過程繁雜且周期長，GeneCopoeia可提供豐富多元的OmicsLinkTM即用型ORF表達克隆。這種即用型即用型表達克隆是將研究基因的ORF裝在帶有不同蛋白標簽的表達載體中，可直接用于體內或體外不同宿主或表達系統的蛋白表達和功能研究，節約了實驗人員耗費在亞克隆步驟上的大量精力和時間。