基因編輯進展梳理PartICRISPR系統拓展及機制研究（一）

基因編輯技術是指對目標基因進行編輯，實現對特定DNA片段的敲除、插入等。自CRISPR/Cas9基因編輯技術問世以來，取得了一系列重大突破，并相繼在2012、2013、2015和2017年被Science雜志評為十大科學進展之一。因此，CRISPR/Cas9以其操作簡便和成本低廉等優勢受到了眾多研究者和投資者的青睞。

如下圖所示：從2011到2018年，NIH對CRISPR相關研究的資助從500多萬美元快速增長到11億美元，而且CRISPR相關科學出版物的數量也從最初的87篇急劇增長到3917篇，這些數據反映了CRISPR /Cas9的巨大潛在價值。

圖1. 2011-2018年期間CRISPR研究經費（左）及出版物數量逐年上升（右）（來源NIH）

2018年，CRISPR系統繼續發力，在多個領域取得突破性的進展，本期我們就先從CRISPR系統開發及機制研究方面來梳理一下相關的重大事件。

一、新型CRISPR系統繼續拓展基因組編輯范圍

自2013年最早公布的spCas9以來[1]，科學家一直致力于在復雜的細菌群體中尋找更多Cas9的同系物來拓展基因編輯工具文庫，以克服現有Cas9系統存在的諸多問題，比如組分太大無法包裝入AAV（腺相關病毒載體）、PAM無法覆蓋整個基因組等等。隨著saCas9，Cpf1和Cas13等相繼問世（如圖），新型基因編輯系統被發現除了編輯DNA，逐漸開始具有編輯RNA以及單雙鏈核苷酸等更多功能，這些新系統的發現不僅拓展了CRISPR的編輯范圍，還延伸了其在諸多領域中的應用。2018年，又有更多有潛力的CRISPR系統相繼被科學家們鑒定并改造。

圖2. 近年來被報道出的 Cas9同系物

1.  CasRx：更強版本的Cas13系統
   2017年底張鋒團隊首次報道發現Cas13系統，確認了其可以靶向哺乳動物細胞中的RNA[2]。

2018年3月15日，Salk研究所的Konermann等人為Cas13家族再添一名新成員：Cas13d。這是一種來自腸道細菌（黃化瘤胃球菌XPD3002）的CRISPR/Cas系統，被命名為CasRx。同Cas13類似，CasRx能夠特異性的靶向并切割RNA，但比其他Cas13分子量小20%。同時CasRx介導的敲低效果相對于其他RNA調控方法具有更高的效率和特異性[3]。

2. 環狀核酸酶（ring nuclease）：病毒防御狀態的終止“開關”

III型效應復合物最近被證明可結合入侵病毒的遺傳物質形成一種環狀寡腺苷酸，俗稱第二信使，這一分子會通過CRISPR相關的Rossman折疊結構域結合并激活核糖核酸酶和其他因子來抵抗病毒的入侵，使細胞進入抗病毒狀態。然而這種狀態的持續激活對細胞是不利的，研究人員推測可能存在某種機制，在病毒被清除后關閉這種狀態。2018年9月19日，Malcolm White團隊證實了這一機制，一種被稱為環狀核酸酶的蛋白可特異性地切割環裝寡腺苷酸，從而終止抗病毒狀態。環狀核酸酶的鑒定增加了人們對CRISPR系統的理解 [4]。

3. Cas14: 目前最小型Cas蛋白，為疾病診斷又添一利器

2018年10月18日，Jenifer Doudna團隊發現了迄今為止最小的功能性CRISPR系統---Cas14上。Cas14只有400-700個氨基酸，但它同Cas12和Cas13一樣，能夠靶向切割單鏈DNA ( ssDNA )，且沒有限制性序列要求，因而會盲目地切割細胞內所有的ssDNA。這一特性使得高保真單核苷酸多態性基因分型成為可能。通過進一步的改進，可以為目前已有的診斷系統（DETECTR）提供更多的選擇[5]。

4. Cas12蛋白新組員，進一步拓展CRISPR系統的工具箱

Cas12a（Cpf1）同SpCas9已被作為最為常用的CRISPR-Cas基因編輯工具，并成功應用于基因組工程的各個領域。相比SpCas9，Cas12a以其較小的體積（1228bp）和僅需單個RNA的引導等優勢被廣泛研究和使用[6]。2018年12月6日來自美國Arbor Biotechnologies的研究人員發現了一組新的Cas12蛋白成員：Cas12c、Cas12g、Cas12h和Cas12i。其中的Cas12c、Cas12h和Cas12i具有RNA導向的雙鏈DNA切割活性，還發現Cas12i在CRISPR的crRNA間隔區的互補鏈和非互補鏈上表現出明顯的切割效率差異，這導致dsDNA形成的主要是單鏈切口（nicking）。Cas12g則主要以核糖核酸酶的形式，通過RNA靶向切割單鏈RNA和單鏈DNA。這項研究揭示了V型CRISPR-Cas系統在不同路線進化中的功能多樣性，同時進一步擴展了CRISPR工具箱的運用范疇[7]。

二、工程化CRISPR系統拓展基因組應用范圍

盡管CRISPR-Cas9系統被廣泛用于基因組編輯，但Cas9可以識別的序列范圍受到特定原間隔基相鄰基序( PAM)需求的限制，因此通常很難實現高精度靶向雙鏈DNA斷裂的基因組編輯應用，這包括目前熱門的單堿基編輯和基于CRISPR的基因篩選等技術。隨著Cas9蛋白組學的深入研究，通過人為引入隨機突變來改變PAM特異性的Cas9衍生物使突破這一限制成為可能。目前，科學家主要通過結構信息、基于定向進化的細菌選擇系統來識別不同PAM序列的Cas9功能突變體，這些Cas9突變體具有與野生型SpCas9相當的編輯能力和特異性。這一技術為尋找高精度的Cas9突變體提供了研究方向，極大地拓展了CRISPR系統工具包，為實現CRISPR系統全基因組編輯打開了大門[8]。

1.  建立新型細菌防御系統篩選系統，開發更多具有潛在價值的分子工具
   

2018年1月25日，來自以色列魏茨曼科學研究所的Rotem Sorek團隊在Science上發文，通過構建出一種掃描所有細菌基因組的計算機程序來研究更多的防御系統基因，將合成的多基因系統插入到天然免疫系統已被滅活的細菌中，通過噬菌體和其他感染因子的篩選，發現細菌存在10種之前未知的細菌免疫防御機制。這些新型防御系統中的任何一種都有可能成為下一種基因編輯工具 [9]。

2. xCas9: 一種能夠識別多種PAM序列的SpCas9突變體

2018年2月28日，David Liu團隊在Nature期刊上發文，他們利用一種噬菌體輔助的連續進化系統 ( PACE ) 進化出一種能夠識別多種PAM序列的SpCas9變體( xCas9 )。xCas9的PAM相容性是迄今為止在所有Cas9識別范圍的哺乳動物中最為廣泛的，并可以應用于人類細胞中，包括靶向轉錄激活、核酸酶介導的基因敲除，單堿基編輯等。值得注意的是，盡管xCas9的PAM兼容性有所擴大，但它的DNA特異性要比SpCas9高得多，在NGG PAMs和非NGG PAMs靶位點中全基因組的脫靶效應也都比spCas9低得多。其中最佳的xCas9 PAMs為NGN，占約四分之一的人類基因組。xCas9的出現極大地擴展了CRISPR系統的DNA靶向范圍，使CRISPR系統變得更加精確和靈活[10]。

圖3. PACE-噬菌體輔助連續進化器模式圖[10]

3. SpCas9-NG：一種識別“NG”PAM序列的Cas9

2018年9月21日，Osamu Nureki團隊通過合理的設計，開發了一種識別NG而不是NGG的SpCas9突變體（SpCas9-NG）。SpCas9-NG增加了靶向范圍，且具有與野生型SpCas9相似的特異性，還可以與其他編輯器（胞苷脫氨酶）一起使用。因此，SpCas9-NG有效地補充了CRISPR工具箱，將在從基礎研究到臨床治療等廣泛應用中發揮重要的作用[11]。

4. ScCas9: 利用生物信息學發現的PAM僅含一個“G”的Cas9

2018年10月24日，來自美國麻省理工學院的研究人員構建了一個自動化的生物信息學管道，通過目標比對搜索PAMs ( SPAMALOT )，進一步探索了被忽略的Cas9鏈球菌直形菌株的微生物PAM多樣性，發現了一種來自犬鏈球菌的Cas9（ScCas9），展示了其在細菌和人類細胞中的精確編輯能力。ScCas9的 PAM序列為5’-NNGTT-3’，且僅含一個堿基G，因此能靶向SpCas9不能的靶DNA序列且位點更多。ScCas9即可作為替代的基因組編輯工具，也可作為發現新的鏈球菌PAM特異性的功能平臺[12]。

三、CRISPR系統核酸酶作用機制研究取得階段性進展

Cas蛋白是CRISPR/Cas系統中的一類核酸酶，目前已鑒定出至少45個Cas蛋白家族。研究人員已通過冷凍電鏡技術來解析其蛋白結構以及作用機制，為認識基因編輯系統的應用以及改造CRISPR系統提供了基本的結構和理論基礎[13]。現在，各種新型Cas蛋白被陸續發現和解析，這將為開發新型CRISPR系統以及在將來高效地運用于基因治療奠定基礎。