李斯特氏菌的檢驗方法（二）

4. 用涂抹棒、海棉或其它采樣設備收集環境樣本。濕潤采樣設備的液體應≤10 mL。濕潤劑可以是無菌水、緩沖蛋白胨水(Buffered Peptone Water, BPW)，或中和緩沖液，如Letheen肉湯或Dey/Engley (DE)中和肉湯。

5）挑取典型菌落接種于TSBYE肉湯管中，35℃培養24h用做糖類發酵和其它生化項目實驗。TSBYE肉湯管在4℃下可存放幾天，也可反復接種。

6）在TSAYE平板上挑取典型菌落刺種到5%的綿羊血或馬血瓊脂平板上，刺種時避免觸到平板底部和使瓊脂破裂，同時設陽性對照（單核細胞增生李斯特氏菌和綿羊李斯特氏菌）和陰性對照（英諾克李斯特氏菌），35℃培養48h。單核細胞增生李斯特氏菌呈窄小的β-溶血環。

7）在明亮的光照下，觀察經穿刺的血瓊脂平板，單核細胞增生李斯特氏菌和西爾李斯特氏菌圍繞穿刺點產生較清晰的β-溶血環，英諾克李斯特氏菌不產生溶血現象，而綿羊李斯特氏菌產生界限明顯的較大溶血環，在此不要試圖進行種間的區分，但要記錄下溶血反應的特征，CAMP試驗可區分它們間的溶血反應。

8）硝酸鹽還原試驗（選做）。用TSBYE肉湯培養物接種于硝酸鹽肉湯中，35℃培養5天后，加入0.2mL試劑A，再加入0.2mL試劑B，混合，出現紫紅色為陽性反應，表明硝酸鹽已被還原，如無顏色出現，在試管內再加入少量鋅粉，放置1h，如出現紫紅色，表明硝酸鹽仍存在，未被細菌還原。只有默氏李斯特氏菌還原硝酸鹽，因此，從格氏李斯特氏菌中區分出默氏李斯特氏菌就必須進行這唯一的試驗。本試驗還有一等效試驗，即加入0.2mL試劑A后，再加入0.2mL試劑C，出現橙色表明硝酸鹽已被還原。如未出現顏色反應，也加入少量鋅粉，若出現橙色表明硝酸鹽未被還原。

5. 在無菌環境下在收集的樣品中添加5 mL，20-30℃，滅過菌的緩沖蛋白胨水(BPW)溶液。不要將Petrifilm EL測試片與Vermont 培養基(UVM)、Fraser肉湯、李斯特菌增菌培養基 (LEB)或緩沖李斯特菌增菌培養基(BLEB)共用。

9）將TSBYE培養物穿刺到SIM和MTM試管中，室溫培養7天，每日觀察，李斯特氏菌呈典型傘狀生長。在MTM中傘狀生長更典型。同時，30℃的TSBYE培養物在油鏡下可見細菌作翻轉運動。

10）將TSAYE肉湯培養物分別接種于0.5%（W/V）葡萄糖、麥芽糖、七葉苷、甘露醇、鼠李糖、木糖發酵管內（可選用倒立發酵管），35℃培養7天，呈陽性反應的李斯特氏菌產酸不產氣，李斯特氏菌發酵鼠李糖和木糖的情況見下表。所有李斯特氏菌對葡萄糖、七葉苷、麥芽糖均能發酵，除格氏李斯特氏菌均不能發酵甘露醇。如果在OXA、PALCAM或加七葉苷/Fe3 的LPM分離平板上菌落色素很明顯，則七葉苷試驗可免做。

6. 混合，蠕動或旋轉樣品與BPW的混合液將近一分鐘。將樣品置于室溫(20-30℃) 1h，最久不超過1.5 h，以修復損傷的李斯特菌。

將TSBYE肉湯培養物接種到3mLTSBYE肉湯中，35℃培養24h，接種2支TSAYE瓊脂斜面，35℃培養24h。用3mL0.01mol/l磷酸鹽緩沖液將斜面菌苔洗下，菌懸液于80℃水浴中加熱1h，以2500r/min離心30，棄去2mL上清夜，將剩余液與沉淀混勻制成菌懸液，進行血清學玻片凝集試驗。