miRNA怎樣蹭上m6A熱點發高分？（一）

文章導讀

胰腺癌是一種惡性程度很高，診斷和治療都很困難的消化道惡性腫瘤，約90%為起源于腺管上皮的導管腺癌。其發病率和死亡率近年來明顯上升。5年生存率<1%，是預后最差的惡性腫瘤之一。m6A甲基化修飾是pri-miRNA加工和成熟的重要機制，但其異常調控在人類疾病中的作用尚不清楚。本研究作者發現，吸煙產生的香煙煙霧冷凝液（cigarette smoke condensate，CSC）能夠通過m6A修飾誘導miR-25-3p前體成熟，從而促進胰腺癌的發生發展。

發表期刊：NATURE COMMUNICATIONS

影響因子：12.353

實驗方法：miRNA測序、m6A pri-miRNA測序、ChIP qPCR、RNA pull down

實驗材料：CSC（香煙煙霧冷凝液），DMSO（普通化學溶解劑），胰腺導管腺癌細胞，胰腺細胞等

技術路線

紅色字體部分的實驗，云序提供一站式服務

文章內容

1. CSC誘導PDAC細胞中致癌基因miR-25-3p過表達

CSC處理胰管上皮細胞和未處理組分別進行miRNA測序（云序可提供此服務），篩選到實驗組中差異高表達的miRNA----miR-25-3p。并且，miRNA的表達量對CSC濃度正相關。前面是細胞中的情況，接著作者檢測了抽煙和不抽煙人群胰腺組織中miRNAs的表達水平，發現miR-25-3p在吸煙者中也是高表達的。在正常和胰腺癌細胞中，也發現miR-25-3p在癌細胞中顯著上調。以上結果表明抽煙和PDAC疾病會導致miR-25-3p的表達量顯著上調。接著作者又結合臨床指標，發現miR-25-3p高表達的PDAC病人生存時間較短。同時，miR-25-3p與細胞增殖、遷移和侵襲表型相關。

圖1. CSC誘導miR-25-3p及其對PDAC患者存活時間的影響

那么問題來了，CSC是如何導致吸煙者體內miR-25-3p的高表達呢？

2.CSC促進METTL3介導的pri-miR-25成熟

為進一步闡明CSC誘導miR-25-3p的分子機制，作者首先檢測了CSC處理PDAC細胞時pri-miR-25、pre-miR-25和miR-25-3p的表達情況，發現CSC處理能夠降低pri-miR-25表達同時增加pre-miR-25和miR-25-3p表達，暗示CSC可能通過調控pri-miR-25的加工和成熟來誘導miR-25-3p的高表達。由于m6A甲基化修飾在miRNA前體加工和成熟過程中起著重要的調控作用，作者檢測了幾個重要的m6A甲基化轉移酶，查看這些酶是否會影響CSC誘導的miR-25-3p的表達，結果發現CSC會誘導METTL3高表達且呈現濃度依賴性，但對METTL14和WTAP表達無影響。隨后，作者做進一步驗證，發現在PDAC細胞中過表達METTL3酶，能夠顯著降低pri-miR-25水平，升高pre-miR-25和miR-25-3p水平，反之亦然。同時，敲減METTL3也顯著降低CSC誘導的miR-25-3p表達。以上數據暗示，CSC可能通過提高METTL3的表達，進而促使miR-25-3p高表達。

圖2.  CSC通過上調METTL3的表達促進了pri-miR-25的成熟

那么問題來了，CSC是如何提高METTL3的表達呢？

3.CSC誘導METTL3啟動子低甲基化并促進其表達

首先，作者通過DNA甲基化低通量驗證技術，證實CSC能夠抑制MeTTL3基因啟動子區域的甲基化程度。通過ChIP-qPCR（云序可提供此服務）實驗，結果顯示CSC處理能夠降低DNA甲基化轉移酶DNMT1和DNMT3a在METTL3啟動子的結合。這種情況在吸煙者的胰腺組織中同樣存在。接著作者通過生信分析確定了調控METTL3的4個潛在轉錄因子，但在腫瘤和非腫瘤的胰腺組織中只有NFIC這個轉錄因子與METTL3的mRNA表達水平呈正相關。為進一步驗證，作者在PDAC細胞中敲減NFIC，發現METTL3和miR-25-3p的表達量顯著降低。此外，吸煙者的非腫瘤胰腺組織中NFIC在METTL3啟動子的結合同樣顯著增加。以上結果表明，CSC通過降低METTL3啟動子區域的DNA甲基化，使其與轉錄因子NFIC結合，進而促進METTTL3的表達。