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  • 發布時間:2020-04-13 21:44 原文鏈接: 常用分子生物學和細胞生物學實驗技術介紹(二)

    核酸原位雜交

    用特定標記的已知順序核酸作為探針與細胞級或組織切片中核酸進行復性雜交并對其實行檢測的方法,稱為核酸原位雜交(nucleic acid hybridization in situ)。用來檢測DNA在細胞核或染色休上的分布,與細胞內RNA進行雜交以研究該組織細胞中特定基因表達水閏;還用于細胞、組織中有無特異性菌、病毒檢測的研究。

    該法的優點是特異性高,可精確定位;能在成分復雜的組織中進行單一細胞的研究而不受同一組織中其他成分的影響;不需要從組織中提取核酸,對于組織中含量極低的靶序列有極高的敏感性;并可完整地保持組織與細胞的形態。因此被廣泛應用于醫學生物學的研究,如基因定位、基因制失,基因易位、特異基因整合部物色檢測等研究。近年來由定性發展到定量,方法更為完善。

    DNA分子克隆技術(也稱基因克隆技術)

    在體外將DNA分子片段與載體DNA片段連接,轉入細胞獲得大量拷貝的過程中DNA分子克隆(或基因克隆)。其基本步驟包括:制備目的基因→將目的基因與載體用限制性內切酶切割和連接,制成DNA重組→導入宿主細胞→篩選、鑒定→擴增和表達。載體(vecors)在細胞內自我復制,并帶動重組的分子片段共同增殖,從而產生大量的DNA分子片段。主要目的是獲得某一基因或NDA片段的大量拷貝,有了這些與親本分子完全相同的分子克隆,就可以深入分析基因的結構與功能,隨著引入的DNA片段不同,有兩種DNA庫,一種是基因組文庫(genomic library),另一種是cDNA庫。

    核酸序列測定

    DNA的堿基序列決定著基因的特性,DNA序列分析(測序,sequencing)是分子生物學重要的基本技術。無論從基因庫中篩選的癌基因或經PCR法擴增的基因,最終均需進行核酸序列分析,可藉以了解基因的精細結構,獲得其限制性內切酶圖譜,分析基因的突變及對功能的影響,幫助人工俁成基因、設計引物,以及研究腫瘤的分子發病機制等。測序是在高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術的基礎上建立起來的。目前最常用的方法有Maxam-Gilbert的化學降解少和Sanger的雙脫氧法等,近年來已有DNA序列自動測定儀問世。化學降解法是在DNA的片段的5`端標記核素,然后用專一性化學試劑將DNA特異地降解,在電泳和自顯影后,可得到從標記端延伸的片段供測讀序列和進行比較。一般能讀出200-250個核苷酸序列。雙脫氧法是采用核苷酸鏈終止劑,如:2`,3`-雙脫氧核苷三磷酸ddNTP(如ddTTP、ddTTP、ddGTP和ddCTP中的一種)摻入到DNA鏈中以終止鏈的延長,與摻入4種正常的dNTP的混合物分成四組進行反應,這樣可得到一組結尾長衙不一、不同專一性核苷酸鏈終止劑結尾的DNA片段,經凝膠電泳分離和放射自顯影,可讀出合成的DNA核苷酸序列,根據堿基互補原則,可推算出模板DNA分子的序列。

    化學降解法只需一化學試劑,重復性好,容易掌握;而雙脫氧法需單鏈模板、特異的寡核苷酸引物及高質量的DNA聚合酶,便隨著M13噬菌體載體的發明和運用,合成的引物容易獲得,測序技術不斷改進,故此法已被廣泛應用。基脫氧法的自動激光熒光測序儀,使測工作更快速和簡便,而且保證高度重復性。至于RNA測序現大多采用將mRNA逆轉錄成cDNA后同測序,然后反推RNA序列

    聚合酶鏈反應技術

    聚合酶鏈反應技術簡稱PCR技術,是一種利用DNA變性和復性原理在體外進行特定的DNA片斷高效擴增的技術,可檢出微量靶序列(甚至少到1個拷貝)。在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應。僅需用極少量模板,在一對引物介導下,在數小時 內可擴增至100萬-200萬份拷貝。PCR反應分三步:變性、退火及延伸。以上三步為一循環,每一循環的產物作為下一個的模板,這樣經過九小時的循環,每一循環的產物作為下一個循環的模板,這樣經過數上時的循環后,可得到大量復制的特異性DNA片段。反應條件一般為94℃變性30秒,55℃退火30秒,70-72℃延伸30-60秒,共進行30次循環左右,最后再延伸72℃5分鐘,4℃冷卻終止反應。


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