微生物菌種的擴大培養技術
菌種的擴大培養是發酵生產的第一道工序，該工序又稱之為種子制備。種子制備不僅要使菌體數量增加，更重要的是，經過種子制備培養出具有高質量的生產種子供發酵生產使用。因此，如何提供發酵產量高、生產性能穩定、數量足夠而且不被其他雜菌污染的生產菌種，是種子制備工藝的關鍵。
一、種子擴大培養的任務
工業生產規模越大，每次發酵所需的種子就越多。要使小小的微生物在幾十小時的較短時間內，完成如此巨大的發酵轉化任務，那就必須具備數量巨大的微生物細胞才行。菌種擴大培養的目的就是要為每次發酵罐的投料提供相當數量的代謝旺盛的種子。因為發酵時間的長短和接種量的大小有關，接種量大，發酵時間則短。將較多數量的成熟菌體接入發酵罐中，就有利于縮短發酵時間，提高發酵罐的利用率，并且也有利于減少染菌的機會。因此，種子擴大培養的任務，不但要得到純而壯的菌體，而且還要獲得活力旺盛的、接種數量足夠的菌體。對于不同產品的發酵過程來說，必須根據菌種生長繁殖速度快慢決定種子擴大培養的級數，抗生素生產中，放線菌的細胞生長繁殖較慢，常常采用三級種子擴大培養。一般50
t發酵罐多采用三級發酵，有的甚至采用四級發酵，如鏈霉素生產。有些酶制劑發酵生產也采用三級發酵。而谷氨酸及其他氨基酸的發酵所采用的菌種是細菌，生長繁殖速度很快，一般采用二級發酵。
二、種子制備的過程
細菌、酵母菌的種子制備就是一個細胞數量增加的過程。細菌的斜面培養基多采用碳源限量而氮源豐富的配方，牛肉膏、蛋白胨常用作有機氮源。細菌培養溫度大多數為37 ℃，少數為28 ℃，細菌菌體培養時間一般1～2天，產芽孢的細菌則需培養5～10天。
霉菌、放線菌的種子制備一般包括兩個過程，即在固體培養基上生產大量孢子的孢子制備和在液體培養基中生產大量菌絲的種子制備過程。
⒈孢子制備
孢子制備是種子制備的開始，是發酵生產的一個重要環節。孢子的質量、數量對以后菌絲的生長、繁殖和發酵產量都有明顯的影響。不同菌種的孢子制備工藝有其不同的特點。
⑴放線菌孢子的制備 放線菌的孢子培養一般采用瓊脂斜面培養基，培養基中含有一些適合產孢子的營養成分，如麩皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些無機鹽等。碳源和氮源不要太豐富(碳源約為1％，氮源不超過0.5％)，碳源豐富容易造成生理酸性的營養環境，不利于放線菌孢子的形成，氮源豐富則有利于菌絲繁殖而不利于孢子形成。一般情況下，干燥和限制營養可直接或間接誘導孢子形成。放線菌斜面的培養溫度大多數為28
℃，少數為37 ℃，培養時間為5～14天。
采用哪一代的斜面孢子接入液體培養，視菌種特性而定。采用母斜面孢子接入液體培養基有利于防止菌種變異，采用子斜面孢子接入液體培養基可節約菌種用量。菌種進入種子罐有兩種方法。一種為孢子進罐法，即將斜面孢子制成孢子懸浮液直接接入種子罐。此方法可減少批與批之間的差異，具有操作方便、工藝過程簡單、便于控制孢子質量等優點，孢子進罐法已成為發酵生產的一個方向。另一種方法為搖瓶菌絲進罐法，適用于某些生長發育緩慢的放線菌，此方法的優點是可以縮短種子在種子罐內的培養時間。
⑵霉菌孢子的制備 霉菌的孢子培養，一般以大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農產品為培養基。這是由于這些農產品中的營養成分較適合霉菌的孢子繁殖，而且這類培養基的表面積較大，可獲得大量的孢子。霉菌的培養一般為25～28 ℃，培養時間為4～14天。
⒉種子制備
種子制備是將固體培養基上培養出的孢子或菌體轉入到液體培養基中培養，使其繁殖成大量菌絲或菌體的過程。種子制備所使用的培養基和其他工藝條件，都要有利于孢子發芽、菌絲繁殖或菌體增殖。
⑴搖瓶種子制備 某些孢子發芽和菌絲繁殖速度緩慢的菌種，需將孢子經搖瓶培養成菌絲后再進入種子罐，這就是搖瓶種子。搖瓶相當于微縮了的種子罐，其培養基配方和培養條件與種子罐相似。
搖瓶種子進罐，常采用母瓶、子瓶兩級培養，有時母瓶種子也可以直接進罐。種子培養基要求比較豐富和完全，并易被菌體分解利用，氮源豐富有利于菌絲生長。原則上各種營養成分不宜過濃，子瓶培養基濃度比母瓶略高，更接近種子罐的培養基配方。
⑵種子罐種子制備 種子罐種子制備的工藝過程，因菌種不同而異，一般可分為一級種子、二級種子和三級種子的制備。孢子(或搖瓶菌絲)被接入到體積較小的種子罐中，經培養后形成大量的菌絲，這樣的種子稱為一級種子，把一級種子轉入發酵罐內發酵，稱為二級發酵。如果將一級種子接入體積較大的種子罐內，經過培養形成更多的菌絲，這樣制備的種子稱為二級種子，將二級種子轉入發酵罐內發酵，稱為三級發酵。同樣道理，使用三級種子的發酵，稱為四級發酵。
種子罐的級數主要決定于菌種的性質和菌體生長速度及發酵設備的合理應用。種子制備的目的是要形成一定數量和質量的菌體。孢子發芽和菌體開始繁殖時，菌體量很少，在小型罐內即可進行。發酵的目的是獲得大量的發酵產物。產物是在菌體大量形成并達到一定生長階段后形成的，需要在大型發酵罐內才能進行。同時若干發酵產物的產生菌，其不同生長階段對營養和培養條件的要求有差異。因此，將兩個目的不同、工藝要求有差異的生物學過程放在一個大罐內進行，既影響發酵產物的產量，又會造成動力和設備的浪費。種子罐級數減少，有利于生產過程的簡化及發酵過程的控制，可以減少因種子生長異常而造成發酵的波動。
三、種子培養
種子培養要求一定量的種子，在適宜的培養基中，控制一定的培養條件和培養方法，從而保證種子正常生長。微生物培養法分為靜置培養和通氣培養兩大類型，靜置培養法即將培養基盛于發酵容器中，在接種后，不通空氣進行培養。而通氣培養法的生產菌種以需氧菌和兼性需氧菌居多，它們生長的環境必須供給空氣，以維持一定的溶解氧水平，使菌體迅速生長和發酵，又稱為好氣性培養。
⒈表面培養法
表面培養法是一種好氧靜置培養法。針對容器內培養基物態又分為液態表面培養和固體表面培養。相對于容器內培養基體積而言，表面積越大，越易促進氧氣由氣液界面向培養基內傳遞。這種方法菌的生長速度與培養基的深度有關，單位體積的表面積越大，生長速度越快。
⒉固體培養法
固體培養又分為淺盤固體培養和深層固體培養，統稱為曲法培養。它起源于我國釀造生產特有的傳統制曲技術。其最大特點是固體曲的酶活力高。
⒊液體深層培養
液體深層種子罐從罐底部通氣，送入的空氣由攪拌槳葉分散成微小氣泡以促進氧的溶解。這種由罐底部通氣攪拌的培養方法，相對于由氣液界面靠自然擴散使氧溶解的表面培養法來講，稱為深層培養法。其特點是容易按照生產菌種對于代謝的營養要求以及不同生理時期的通氣、攪拌、溫度與培養基中氫離子濃度等條件，選擇最佳培養條件。
⑴深層培養基本操作的三個控制點
①滅菌 發酵工業要求純培養，因此在種子培養前必須對培養基進行加熱滅菌。所以種子罐具有蒸汽夾套，以便將培養基和種子罐進行加熱滅菌，或者將培養基由連續加熱滅菌器滅菌，并連續地輸送于種子罐內。