在New Brunswick S41i CO2恒溫搖床內采用透氣袋實現人類T細胞快速擴增
摘要
近年來細胞治療領域取得的進步大大提升了對T細胞擴增技術的需求。 T細胞必須能夠迅速擴增， 才能在維持高存活率和T細胞屬性的同時達到高細胞密度。
攪拌罐生 物反應器是實現大規模擴增的最佳細胞培養工具之一。 然而， 在生物反應器內進行細胞培養需接種大量細胞。
我們開發出了利用透氣袋為臺式生物反應器接種生產 足量T細胞的方法。
我們利用放置在New Brunswick S41i CO2恒溫搖床內的透氣袋進行懸浮T細胞培養， 并測試了來自不同制造商的細胞培養袋，
最大灌注量從120 mL到5 L不等。 此外， 我們還測試了不同的振蕩速度， 以確定T細胞擴增的最佳條件。 由于T細胞放置在固定平臺上無法生長，
所以需要適當的振蕩。 我們還探索了更傳統的利用振蕩搖瓶 進行懸浮培養的方法。 結果表明， 使用透氣袋更為成功，
不到4天其擴增量就超過了10倍， 而在搖瓶中則只擴增了2 - 3倍。 綜上所述， 我們利用透氣袋和CO2恒溫搖 床，
建立了一種在攪拌罐生物反應器內大規模制備培養T細胞的方法。
介紹
在過去的幾年里， 許多研究和開發實驗室一直在研究可以實現T細胞大量生長的條件， 以支持細胞治療應用對高質量T細胞需求的增長。 一直以來，
血庫實驗室進行T 細胞培養的主要目標都是維持細胞群以便后續輸注。 該技術尚無法滿足研發和商業使用所需的水平。
利用生物反應器培養法擴增細胞是經過充分論證的， 但還沒有 針對淋巴細胞進行充分地優化。 實際上， T細胞敏感而脆弱，
既往實驗都證明很難為臺式生物反應器接種生產足夠的細胞。
其他的懸浮哺乳動物細胞， 包括諸如干細胞等敏感細胞， 可以如前所示， 利用CO2控制的恒溫搖床成功在搖瓶中培養[1]。 然而，
鑒于我們利用搖瓶法對原代人類T細 胞進行培養的初步研究并未取得成功。 因此， 我們又開發出了在New Brunswick S41i
CO2恒溫搖床（艾本德， S41I1200100） 中通過振蕩透氣袋來培養這些T細胞的 新方法。 該方法顯著優化了T細胞培養，
得到了能夠為臺式生物反應器接種生產出足量T細胞的快速有效的初始擴增條件。 例如， 在臺式研究中， 我們采用了一臺 BioBLU?
3c一次性罐（艾本德， 1386000300） ,設置為最大工作容積(3.75 L)， 目標細胞接種密度為0.5 x 106 cells/mL，
則生物反應器接種總共需要1.88 x 108個細 胞。 該研究還建立了低溫保存T細胞的方法， 這對此項研究至關重要。 通過建立低溫保存庫，
可將相同批次的細胞用于多個優化實驗。
材料和方法
本研究采用一臺New Brunswick S41i Co2恒溫搖床進行T細胞擴增操作， 所用設備和試劑的完整列表見表1。
表1： 本研究所用設備、 耗材和試劑列表
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培養基配方和恒溫搖床設置
本研究的完全培養基配方包括Lonza的X- VIVO 10基礎培養基（不含慶大霉素和酚紅）， 還添加了5%熱滅活人血清、 2 mM谷氨酰胺、 2 mM抗菌-抗真菌劑， 以及20 μg/mL IL-2。
在所有研究中， S41i Co2恒溫搖床都設置為5% CO2 水平。 將懸浮方瓶中生長的T細胞培養物放置在靜置架上。
在Evolve袋中生長的T細胞培養物則放置在振蕩平臺 上， 并利用膠帶將袋子各邊粘在平臺上將其固定（圖1）。 固定住袋子后，
將搖床設置為默認的70 rpm振蕩速度（除非另有說明）。 本研究的其余部分也采用該等設定 值和培養基配方。 如圖1所示， S41i
Co2恒溫搖床可用于多種不同的T細胞培養方法。
圖1： S41i恒溫搖床能夠同時支持搖瓶、 懸浮T-25方瓶和細胞培養袋進行T細胞培養
優化Evolve透氣袋中的T細胞解凍和初始培養
我們對從STEMCELL Technologies購得的一瓶原代人外周血全T細胞采用了兩 種不同的方法進行了解凍，
兩種方法都使用了ThawSTAR CFT2自動解凍儀對瓶 裝細胞進行解凍操作。 STEMCELL
Technologies建議將T細胞解凍至T-25方瓶， 并靜置兩天。 使用5 mL最大灌注量的新鮮完全培養基。 T細胞培養的頭兩天遵循
該方案， 然后將細胞轉移至Evolve袋中繼續培養。 為了確定實現最佳細胞生長和 存活率是否有必要采取靜置培養步驟， 我們評估了另一種方法，
即直接將瓶裝細 胞解凍至120 mL的Evolve細胞培養袋中。 在研究的這部分中采用的是80 mL工作 容積的Evolve袋。
使用Vi-CELL Xr細胞存活率分析儀每天對兩種方案進行取樣和 計算， 以監測細胞的生長和存活率。此外， 還使用了Life
Technologies的EVOS FL 細胞成像系統檢查120 mL Evolve袋內的培養物。 圖2顯示的是以10X放大倍數拍
攝的人類外周血全T細胞。
圖2： 使用Life Technologies的EVOS FL細胞成像系統在10X放大倍數下拍攝的Evolve 120 mL細胞培養袋內的T細胞生長情況