提起 PCR，在生物及其相關行業內可謂如雷貫耳，無人不知無人不曉，其影響之深，應用之廣可見一斑。
1985 年，美國 PE-Cetus 公司的 Mullis 等人發明了聚合酶鏈反應（PCR），實現了在試管中模擬細胞內的 DNA
復制。然而，采用 E-coli DNA 聚合酶進行 PCR，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時，費力，且易出錯。1988 年 Saiki
等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌 (thermus aquaticus) 中提取到一種耐熱 DNA 聚合酶。 耐熱 DNA 聚合酶的應用使得
PCR 能高效率的進行，隨后 PE-Cetus 公司推出了第一臺 PCR 自動化熱循環儀，從此拉開了 PCR 大展拳腳的序幕。
根據 PCR 的發展進程，本文將對普通 PCR、實時熒光定量 PCR 和數字 PCR 這三代 PCR 進行分析，期望對 PCR 感興趣的讀者能從中有所收獲。
普通 PCR
基本原理
PCR（聚合酶鏈式反應）是一種體外 DNA 擴增技術，是在模板 DNA、引物和 4 種脫氧核苷酸存在的條件下，依賴于 DNA 聚合酶的酶促合反應，將待擴增的 DNA 片段與其兩側互補的寡核苷酸鏈引物經「高溫變性—低溫退火 —引物延伸」三步反應的多次循環，使 DNA 片段在數量上呈指數增加，從而在短時間內獲得我們所需的大量的特定基因片段。DNA 的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。
PCR 反應體系舉例
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10×擴增緩沖液?????? |
10μl? |
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4 種 dNTP 混合物??? |
各 100～250μmol/L |
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引物??????????? ???? |
各 5～20μmol/L |
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模板 DNA??????? ?????? |
0.1～2μg |
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Taq?DNA 聚合酶??? |
5~10U |
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Mg2+????????? ??? |
1～3mmol/L ? |
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加雙或三蒸水至???? |
100μl |
儀器與耗材
基于聚合酶制造的 PCR 儀實際就是一個溫控設備，能在變性溫度、復性溫度和延伸溫度之間很好地進行控制。這些儀器主要用變溫鋁塊、變溫水浴及變溫氣流的方式達到熱循環的目的，各有其優缺點，在此不再贅述。
結果檢測
PCR 反應擴增出很高的拷貝數，下一步檢測就成了關鍵。熒光素（溴化乙錠，EB）染色凝膠電泳是最常用的檢測手段。電泳法檢測特異性不太高，引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判，但因為其簡捷易行，成為了主流檢測方法。
應用
PCR 是一種用于放大擴增特定的 DNA 片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊 DNA 復制，最大特點是能將微量的 DNA 大幅增加。因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發、皮膚或血液，只要能分離出一丁點的 DNA，就能用 PCR 加以放大，進行比對。這也是「微量證據」的威力之所在。
實時熒光定量 PCR（Quantitative Real-time PCR,qPCR）
基本原理
qPCR 技術是在反應體系中加入熒光報告基團和熒光淬滅基團，隨著 PCR 反應的進行，擴增產物不斷積累，導致熒光信號不斷積累， 從而利用熒光信號的變化實時監測整個 PCR 進程。
根據 PCR 定量原理公式可推導出， 模板起始拷貝數的對數與閾值循環數呈線性關系，模板起始拷貝數越多，熒光信號達到閾值的循環數越少，即
Ct 值越小。利用已知起始拷貝數的標準樣品繪制標準曲線，根據熒光基團發出的熒光強度與 PCR 擴增產物的數量呈對應關系，
只要對熒光信號進行實時監測并得到未知樣品的 Ct 值，即可通過標準曲線計算未知樣品的起始拷貝數。
Ct 值指 PCR 擴增過程中，擴增產物的熒光信號達到設定閾值時所經過的擴增循環數。相同模板進行 96 次擴增，終點處產物量不恒定，但 Ct 值卻極具重現性。
