普通PCR、實時熒光定量PCR和數字PCR對比分析（二）

模板 DNA 量越多，熒光達到域值的循環數越少，即 Ct 值越小。Log 起始模板濃度與 Ct 呈線性關系，通過已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，根據樣品 Ct 值，就可以計算出樣品中所含的模板量。

目前常用熒光標記方法

方法	優點	缺點	應用范圍
SYBR Green I	適用性廣 靈敏 方便 便宜	引物要求高 易出現非特異條帶	科研中對各種目的基因定量分析，基因表達量的研究，轉基因重組動植物研究
Taqman	特異性高 重復性好	價格高 只適合特定目標	病原體檢測，疾病耐藥基因研究，藥物療效考核，遺傳疾病診斷
分子信標	高特異性 熒光背景低	只適合特定目標 設計困難 價格高	特定基因分析，SNP分析

 

熒光定量 PCR 反應體系舉例
試劑	含量
2xGoTaq Master Mix	5μl
無核酸酶水	3.5μl
上游引物	0.25μl
下游引物	0.25μl
基因組 DNA	1μl（約20ng）梯度稀釋
共 10μl

儀器與耗材

在普通 PCR 儀的基礎上增加一個熒光信號采集系統和計算機分析處理系統，就成了熒光定量 PCR 儀。其 PCR 擴增原理和普通 PCR 儀擴增原理相同，只是 PCR 擴增時加入的引物是利用同位素、熒光素等進行標記，使用引物和熒光探針同時與模板特異性結合擴增。擴增的結果通過熒光信號采集系統實時采集信號連接輸送到計算機分析處理系統得出量化的實時結果輸出，把這 PCR 儀叫做實時熒光定量 PCR 儀 (qPCR 儀)。熒光定量 PCR 儀有單通道，雙通道，和多通道。當只用一種熒光探針標記的時候，選用單通道，有多熒光標記的時候用多通道。單通道也可以檢測多熒光的標記的目的基因表達產物，因為一次只能檢測一種目的基因的擴增量，需多次擴增才能檢測完不同的目的基因片段的量。該儀器主要用于醫學臨床檢測，生物醫藥研發，食品行業，科研院校等機構。

     

實時熒光定量 PCR 與普通 PCR 對比

	實時熒光定量 PCR	普通 PCR
檢測	熒光檢測	電泳跑膠
特異性	引物和熒光探針，特異性高	引物，特異性低
靈敏度	熒光檢測靈敏度高	電泳檢測相對較低
自動化程度	無需跑膠，自動化程度高	結束后再跑膠
結果	全程監控，準確的算法進行定量	定性
污染	封閉體系，環境污染少	污染可能性大

應用

定性分析研究：雜合或純合子鑒定，SNP 分析等。

絕對定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷貝數定量分析，GMO 定量檢測等。

相對定量研究：mRNA 表達分析，siRNA 效果確認，差異顯示結果驗證等。

1992 年，Sykes 等從非淋巴細胞和正常體細胞背景中鑒定突變的白血病細胞，檢測了復雜背景下低豐度的 IgH 重鏈突變基因。該研究中提出了三個重要的原則：有限稀釋、終點信號的有或無及對數據泊松分布的統計處理，為以后 dPCR 的發展奠定了基礎，逐步拉開了 Digital PCR 研究和應用的序幕......

參考文獻：

1. 王玉倩,薛秀花.實時熒光定量PCR技術研究進展及其應用[J].生物學通報，2016, 51(2).

2. 馮彩寧,熒光定量PCR實驗原理及數據分析，生工生物工程（上海）有限公司.

3. 張志坤,實時熒光定量PCR的原理、操作及其應用,河南農業大學生命科學研究中心.

4. PCR技術發展和應用,百度文庫.