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  • 發布時間:2020-04-20 21:21 原文鏈接: KinExA分子與完整細胞相互作用系統的原理與應用(二)

    結果表明,CAR-T細胞與抗原的親和力Kd為45.41pM,T細胞表面CAR的表達水平為1.368e+5,Kd與EL的95%置信區間均較窄,數據非常準確可信。

    應用二、KinExA在高親和力檢測上應用

    對于抗腫瘤藥市場,目前精準醫療最為成熟的領域還是以靶向藥物為代表的抗腫瘤藥物。由于單克隆抗體類抗癌藥的副作用較小,且靶向性更好,因此,單抗藥物仍將是引領抗腫瘤藥物發展最為重要的領域。以PD-1為靶點的一類單抗藥呈現出較高的親和力,常規的相互作用檢測系統例如SPR 、BLI、ITC等由于自身原理的限制均不能檢測高親和力(pM級別)。KinExA技術有別于常規的相互作用檢測系統,能準確有效的檢測高親和力(fM級別)。

    下表是Pfizer, Rinat兩家公司聯合發表的KinExA高親和力檢測范圍的文章。

     

    Bee C., et al. 2012. Exploring the dynamic range of the kinetic exclusion assay in characterizing antigen-antibody interactions. PLOS ONE 7(4): e36261.

    五、案例分析

    案例一:完整細胞的相互作用檢測

    背景:單克隆抗體XMetA是胰島素受體(IR)變構部分的激動劑,其激活代謝Akt激酶信號通路,而對有絲分裂胞外信號調節激酶(ERK)信號通路幾乎沒有影響。為了研究這種選擇性信號通路的性質,作者驗證了XMetA對CHO細胞中IR,Akt和ERK的特異性磷酸化和活化的影響。

    目的:完整細胞親和力檢測。

    方法:研究者將表達短鏈型(IR-A)及長鏈型(IR-B)胰島素受體的不同濃度CHO細胞分別與XMetA孵育,通過離心獲得游離的XMetA,用KinExA儀器檢測親和力。另外,作者采取同樣的策略,用KinExA儀器檢測胰島素與CHO細胞表面IR-A,IR-B的親和力。

    結論:XMetA與IR-A亞型的親和力為55±16pM,與IR-B亞型的親和力為50±11pM。另外,在對照抗體組,胰島素與IR-A亞型的親和力為156±14pM;在XMetA組,胰島素與IR-A亞型的親和力為216±100pM;在對照抗體組,胰島素與IR-B亞型的親和力為221±28pM;在XMetA組,胰島素與IR-B亞型的親和力為277±112pM。數據同時說明, XMetA與IR亞型的結合與胰島素無關。

    Bedinger, D., et al. 2015. Differential pathway coupling of activated insulin receptor drives signaling

    selectivity by XmetA, an allosteric partial agonist antibody. J Pharmacol Exp Ther 353(1):35-43.

    案例二:細胞與上清未純化樣品檢測

    背景:單克隆抗體(mAb)在體內與膜蛋白間親和力的可靠評估是腫瘤治療的主要問題。在BV展示系統中,膜蛋白能以天然狀態在病毒表面展示。

    目的:細胞與上清中未純化樣品親和力檢測。

    方法:研究者基于KinExA技術,結合桿狀病毒(BV)膜蛋白展示系統,描述了一個簡單而高度敏感的單克隆抗體評估方法。

    結論:在BV表面展示的肝癌抗原Robo1吸附到磁珠上(BV beads),其KD值(~10pM)與全細胞分析方法一致(R2=0.998),表明基于KinExA技術檢測方法提供了針對細胞表面蛋白的單克隆抗體親和力準確的評估。

    Kusano-Arai 0., et al. 2016. Kinetic exclusion assay of monoclonal antibody affinity to the membrane protein Roundabout 1 displayed on baculovirus. Anal Biochem.

    案例三:高親和力檢測

    背景:白細胞介素-1β(IL-1β)是炎癥反應的有效介質,在許多淋巴細胞的分化中發揮調控作用。在一些炎癥和自身免疫性疾病中,血清中IL-1β水平與疾病的發展和嚴重程度相關。 IL-1β在一些疾病中的機理已經被臨床試驗證實,并獲得FDA的審批。

    目的:高親和力檢測與驗證。

    方法:設計抗IL-1β抗體XOM052,SPR檢測其與IL-1β的親和力為≤4pM。另外實驗采用Protein A捕獲IL-1β抗體,解離10min,發現時間不足以使抗體抗原發生解離,將解離時間延長至4h,解離早期無法準確擬合,推測是由于IL-1β抗體從Protein A上解離對實驗造成的影響。為了更精確的計算親和力,作者改用KinExA,分析得到其親和力為300fM。

    結論:KinExA技術對于高親和力的檢測具有無可替代的優勢。

     

    Owyang A.M., et al. 2011. XOMA 052, a potent, high-affinity monoclonal antibody for the treatment of IL-1B-mediated diseases. mAbs 3(1): 49-60.

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