南京醫科大學第一附屬醫院腫瘤科副主任醫師殷詠梅教授長期從事消化道腫瘤和乳腺腫瘤的內科治療，近來，其實驗室利用tRF&tiRNA測序，發現在曲妥單抗敏感和耐受的乳腺癌細胞中，tRNA來源的小非編碼RNA分子tRF&tiRNA表達差異顯著。其中tRF-30-JZOYJE22RR33和tRF-27-ZDXPHO53KSN在Trastuzumab（曲妥單抗，一種抗乳腺癌藥物）耐受的臨床病人中明顯上調。結合臨床信息分析顯示，這兩個tRF表達上調的曲妥單抗耐藥乳腺癌病人與更差的無進展生存期具有明顯的相關性，預示著這兩個tRF可作為潛在的不良預后的生物標志物。該研究成果發表在2018年8月的Cellular
Physiology and Biochemistry（IF：5.104）。（tRF&tiRNA測序由康成生物提供技術服務）
| 什么是tRF&tiRNA? tRF（15-30nt）和tiRNA(30-35nt)是由Dicer酶或ANG酶在多種條件下，精確地、特異性的切割tRNA后產生的小非編碼RNA。已有多項研究表明，tRFs和tiRNAs作為sncRNA執行多種生物學功能。它們能夠作為miRNA行使RNA干擾；替換與mRNA結合的翻譯起始因子eIF4G，直接抑制蛋白的翻譯過程；結合某些蛋白因子，例如YBX1，影響mRNA的穩定性 ；與細胞色素C相互作用，調控細胞凋亡；在應激條件下促進應激顆粒 (Stress Granules, SGs) 的組裝；敏化細胞氧化應激誘導的p53激活以及p53依賴的細胞死亡；作為父代表觀遺傳因子，改變子代基因轉錄級聯過程等。 >>詳細內容請見：tRF&tiRNA：為什么以及如何研究它們？ |
研究背景
約20%-25%的乳腺癌病人中人上皮生長因子受體-2（HER-2）表達上調，且HER-2與不良預后相關。曲妥單抗是一個HER-2的單克隆抗體，可明顯提高乳腺癌病人的生存期。但大多數病人在接受曲妥單抗治療后，會產生抗性，因此尋找HER-2陽性的乳腺癌患者產生曲妥單抗耐藥性的分子機制已成為迫切需求。
研究發現，在特定的細胞或組織中或者在細胞受到脅迫等特定條件下，由核酸酶（如 Dicer、血管生成素ANG等）在 tRNA
的環上剪切，產生的小片段 RNA，根據切割位置不同可分為tRNA halves(tiRNA)和tRNA-derived
fragments(tRFs)。已有多篇文章報道，tRF&tiRNA可以作為mRNA或蛋白sponge調控mRNA穩定性、蛋白翻譯，從而影響細胞周期，細胞增殖，細胞凋亡，影響腫瘤發生發展，同時由于tRF的穩定性高、特異性好，也可以作為無進展生存期的指標和預后生物標志物。對于tRF&tiRNA的研究已經成為small
RNA領域的熱點。
研究思路
作者先檢測了人乳腺癌細胞系SKBR3和JIMT-1對曲妥單抗濃度和作用時間的應答，發現SKBR3比JIMT-1對曲妥單抗更加敏感。然后抽取正常乳腺細胞系HBL-100，癌細胞系SKBR3和JIMT-1細胞的總RNA進行測序，共檢測到了6309個tRNA片段。經數據分析，其中998個tRNA片段超過兩倍差異。然后作者挑選與HBL-100和SKBR3相比，JIMT-1最明顯的5個上調和1個下調的tRFs進行原樣本qPCR驗證，與測序結果相符。
最后，作者擴大臨床樣本qPCR驗證，檢測了28個曲妥單抗敏感的臨床病人和29個具有抗性的臨床病人，結果顯示在具有抗性的病人中tRF-30-JZOYJE22RR33和tRF-27-ZDXPHO53KSN表達上調。受試者工作特征曲線（ROC）和無進展生存曲線分析顯示，高表達的tRF-30-JZOYJE22RR33和tRF-27-ZDXPHO53KSN是兩個較好的不良預后標志物。
技術路線
結果展示
圖1. 高通量測序檢測在HBL-100，JIMT-1和SKBR3中差異表達的tRFs，經生信分析，其中有998個差異表達的tRFs
圖2. qPCR驗證6個差異顯著的tRFs，與測序結果相符
圖3. qPCR驗證敏感和耐藥病人血清來源的tRFs，結果顯示tRF-30-JZOYJE22RR33 和 tRF-27-ZDXPHO53KSN明顯下調。
圖4. ROC曲線和無進展生存期曲線顯示tRF-30-JZOYJE22RR33 和 tRF-27-ZDXPHO53KSN
可作為曲妥單抗耐藥性的潛在Biomarker
研究意義
本研究運用tRF&tiRNA測序發現在HER-2陽性的曲妥單抗耐藥的細胞株中，有998個tRFs表達存在兩倍以上差異。研究顯示，tRF-30-JZOYJE22RR33和tRF-27-ZDXPHO53KSN在曲妥單抗耐藥的過程中具有重要的作用。tRF-30-JZOYJE22RR33和tRF-27-ZDXPHO53KSN高表達的病人，從曲妥單抗的治療中獲益更少，預示著這兩個tRFs可以作為曲妥單抗耐藥病人潛在的分子標志物和干擾靶標進行臨床治療。
原文出處
tRNA-Derived Fragments as Novel Predictive Biomarkers for Trastuzumab-Resistant Breast Cancer. Cellular Physiology and Biochemistry.2018.