飼料中的氯霉素的測定——氣相色譜法

引言

氯霉素（Chloramphenicol， CAP） 是一種廣泛使用的廣譜類抗生素， 由于它對人體具有嚴重的毒副作用 [1]， 醫學界至今還沒有確定氯霉素的人體安全接觸劑量。 美國和歐盟都禁止在食用性動物和動物飼料中使用氯霉素 [2]， 在法規中CAP 的殘留量為不得檢出。

氣相色譜的 ECD 檢測器對于具有強電子親和力的化合物有較高的靈敏度， 而本實驗采用 Thermo Scientific Trace1310 氣相色譜，在分析飼料中的氯霉素時，簡單、 方便，重現性好。

實驗材料

儀器與試劑

Trace 1310 氣相色譜儀， 配備了 SSL（分流 / 不分流進樣口），ECD( 電子捕獲檢測器 )；

自動進樣器： AS 1310

色譜工作站： Chromeleon 7.2

氯霉素標準品（99.5%）； 衍生化試劑： 三氟雙（三甲基硅烷基） 乙酰胺（BSTFA） + 三甲基氯硅烷（TMCS）（99:1，美國 SUPELCO 公司） C18 固相萃取柱（美國 SUPELCO 公司），填料 300mg； 乙酸乙酯， 正己烷， 甲醇， 乙腈均為色譜純，氯化鈉為分析純。

樣品： 購自山東豬飼料

實驗方法

1. 標準溶液配制

電子天平準確稱取 10.0mg 氯霉素標準品， 色譜純甲醇溶解定容到 100ml， 充分搖勻， 配制成 100ug/ml 的標準溶液儲備液， 置于 4℃冰箱中保存。 制作工作曲線時， 再取此儲備液用甲醇配制成其他濃度的標準溶液。

2. 樣品預處理方法 [3]：

2.1 提取

稱取飼料 5.00g 左右， 置于 50ml 塑料離心管內， 加入 40ml乙酸乙酯， 蓋好密封蓋于渦旋混合器上混合 2min， 超聲提取 20min。 離心機上 4000r/min 離心分離 4min， 取上清液20.0ml， 用氮氣吹至近干， 待凈化。

2.2 液液萃取凈化

稱取 4.0g 氯化鈉加水溶解定容到 100ml， 配制 4% 的氯化鈉溶液。 取 20ml 甲醇加 4% 的氯化鈉溶液 80ml， 配制成氯化鈉甲醇溶液。 用氯化鈉甲醇溶液 2ml 分三次溶解殘渣，均轉移到一個 15ml 的具塞離心管中， 加 4ml 正己烷， 渦旋混合 2min。 然后 4000r/min 離心 4min， 吸取上層正己烷棄去，重復上述操作一次。 水相加乙酸乙酯 3ml， 混合 2min，4000r/min 離心 4min， 吸取上層乙酸乙酯， 同樣的步驟重復兩次。 然后氮氣吹干， 用 3ml5% 的乙腈 - 水溶解， 待柱凈化。

2.3 固相萃取柱凈化

準備好 C18 小柱， 順序用 5ml 甲醇， 5ml 三氯甲烷， 5ml 甲醇和 5ml 水活化 C18 柱。 將處理好的樣品轉移到柱上， 用5ml 水淋洗， 然后用 6ml 乙腈洗脫， 收集在離心管中， 用氮氣吹干， 待衍生化。

2.4 衍生化

向干的殘留物中加入 100ul 衍生化試劑， 蓋塞并渦旋混合 10s。 在 65℃的水浴中反應 60min， 然后用氮氣吹除多余的試劑。 加入 0.25ml 正己烷， 渦旋混合 10s， 供色譜分析使用。 標準溶液， 吹干后， 采用同樣的衍生化方法處理。

3. 測定

3.1 色譜條件

分析結果與譜圖

1. 氣相色譜對氯霉素分析結果

采用 ECD 檢測器對氯霉素衍生化樣品進行分析， 得到的譜圖如圖 1 所示：

2. 工作曲線、 回收率和精密度

配置濃度分別為 200,100,50,20,10,5ug/L 的標準樣品， 衍生化后， 用 ECD 模式下檢測， 得到的線性、 檢出限結果如表 2所示

稱取飼料樣品， 分別添加 2 個水平濃度的標準品， 每個濃度水平平行測定 5 次。 結果表明， 平均回收率為 80-85%，相對標準偏差（RSD, n=5） 為 1.4-5%。 回收率和精密度數據結果見表 3。

3. 實際樣品

稱取 5.0g 購得的豬飼料中， 平行檢測兩次， 未檢出氯霉素殘留

結論

Thermo Scientific 的氣相色譜 Trace 1310 分析飼料中的氯霉素檢測限可以達到 2ug/kg, 定量限達到 5ug/kg, 優于 GB/T8381.9-2005 中對于飼料中氯霉素 5ug/kg 的檢測限要求。 在分析氯霉素質量濃度為 5-200ug/kg 時， 線性良好， 重現性。

參考文獻

[1] 蔣定國， 楊大進， 動物性食品中氯霉素殘留檢測技術的研究概況 [J]. 中國食品衛生雜志： 2002,14（2）： 44-47；
[2] 徐繼林， 嚴小軍， 徐年軍， 馮凱， 對蝦中殘留氯霉素的化學源 GC/MS 分析 [J].中國水產科學： 2004,11（2）： 111；
[3] GB/T 8381.9-2005 飼料中氯霉素的測定 氣相色譜法： 2-3