策略4 Tnnt2-Dre;Actb-Cre;NR1 通過NR1系統研究非肌細胞向肌細胞的轉化
雖然利用廣泛型啟動子驅動的可誘導Cre或Dre可以有效標記大多數非肌細胞，但實際上標記效率并未達到100％。少數未標記的非肌細胞在損傷后在成體心臟中產生新的肌細胞也仍舊是有可能的，雖然可能性并不大，因為在譜系示蹤期間的標記過程是完全隨機的。為了達到100％的非肌細胞標記效率，利用NR報告基因小鼠（見下圖），設計了第4種策略。
在這個系統中，ZsGreen標記小鼠所有的細胞，除了被tdTomato標記的新形成的肌細胞。Actb-Cre-loxP重組之后NR1小鼠中的所有細胞首先被標記為ZsGreen綠色熒光，只有新的肌細胞在形成時由于第二個Tnnt2-Dre-rox的重組而開啟tdTomato紅色熒光的標記（圖5A）。綠色熒光蛋白在哺乳動物細胞中有12-24小時的半衰期，所以盡管肌細胞中的Dre-rox重組會導致tdTomato表達，但ZsGreen蛋白在降解前仍有穩定的標記時間。因此可以在非肌細胞向肌細胞轉化期間檢測到雙陽性細胞。
圖5. A
首先分析之前實驗中的胚胎心臟（圖5B）來測試這個系統。很容易在E8.5天發育的心臟流出道中檢測到tdTomato+ZsGreen+肌細胞（箭頭，圖5C），這與以前的研究結果一致，表明第二心區祖細胞在這個階段分化成心肌細胞。
然后，在MI造模28天期間每12小時間隔收集小鼠心臟樣本進行分析（圖5B）。對于ZsGreen、tdTomato和TNNI3免疫染色，結果顯示在梗塞心肌中沒有ZsGreen+tdTomato+肌細胞（圖5D）。所有56個時間點的Tnnt2-Dre;Actb-Cre;NR1小鼠心臟樣本，超過6000個心臟切片中未檢測到任何ZsGreen+tdTomato+肌細胞。類似地，分離心肌細胞進行流式細胞分析在ZsGreen+細胞中也沒有發現肌細胞（圖5E）。
相反，陽性對照實驗中很容易在受損TA肌肉中檢測到ZsGreen+tdTomato+肌細胞（圖5F）。在Tnnt2-Dre;Actb-Cre;NR1小鼠心臟切片中非肌細胞100%被ZsGreen標記（補充材料）。
圖5.
綜上所述，使用基于Tnnt2-Dre;Actb-Cre;NR1的第4種譜系示蹤策略的結果顯示，非肌細胞向肌細胞的轉化只在胚胎期而不在成體心臟中出現。
除了成體心臟中的心肌細胞外，還有多種具有已知分子標記的非肌細胞細胞譜系。對于這些不同的細胞群，用不同的Marker啟動子驅動重組酶構建工具鼠，來追蹤非肌細胞的細胞命運，如：
內心細胞：Npr3-CreER；
間充質干細胞或成纖維細胞：Sox9-CreER、Vim-CreER、Postn-CreER；
內皮細胞：Cdh5-CreER；
周細胞或平滑肌細胞：Myh11-CreER、Pdgfrb-CreER、NG2-CreER；
心外膜細胞：Wt1-CreER；
作為對照，用aMHC-MerCreMer來示蹤心肌細胞。
對這10種工具鼠進行他莫昔芬誘導，兩周后進行MI造模或假手術，并在心臟損傷4周后收集心臟組織樣本（見下圖B）。在這10個小鼠品系的心臟切片上的tdTomato和肌細胞標記TNNI3染色顯示，在假手術或MI后除了來自已存在的心肌細胞外，并沒有來自上述這些不同細胞譜系對肌細胞的貢獻（下圖C，D）。這些結果表明，所有這些非肌細胞都不參與向新的肌細胞轉化，而aMHC-MerCreMer示蹤數據顯示，受損心肌中的所有心肌細胞均來源于已有的心肌細胞（下圖C，D）。
圖6. A-D
利用新建立的雙同源重組技術系統的這項研究，由哪些臨床意義呢？
表明假定的Sca1+，Bmi1+，Isl1+，Abcg2+或其他干細胞群體在成體階段對于心臟再生并不具備生肌潛能。
心肌細胞是心臟再生的主要細胞來源。
這種新的遺傳學系統提供了前所未有的策略，來研究假定的成體干細胞對組織修復和多器官系統再生的貢獻。