近年來，CRISPR/Cas9基因編輯技術正在給整個科研界帶來革命性變化，該技術使用CRISPR系統將Cas9蛋白和向導RNA注入小鼠受精卵，就能輕松實現基因敲除，同時，注入Donor DNA則可實現基因敲入，甚至國際著名學術期刊Genome Biology有文章指出這項新技術將很快取代使用胚胎干細胞的基因修飾，看起來小鼠胚胎干細胞基因修飾技術的終結不可避免。
然而，事實是這樣嗎？
脫靶效應仍存爭議
CRISPR/Cas9這一被稱為“魔剪”的基因編輯工具在基因工程應用方面被寄予厚望。但是，脫靶效應這一有爭議的老問題一直影響著CRISPR/Cas9系統的應用。有文獻報道，CRISPR/Cas9的切割是通過gRNA與基因組位置之間20bp堿基的配對，且配對堿基的 5′ 端需要有PAM結構，再引導Cas9作用實現的，但是CRISPR/Cas9與靶位點識別的特異性主要依賴于gRNA與靠近PAM處10-12bp堿基的配對，而其余遠離PAM處8-10bp堿基的錯配對靶位點的識別影響不明顯，這項研究直接說明了CRISPR/Cas9存在嚴重的脫靶性，即該技術可以發生非特異性切割，引起基因組非靶向位點的突變，這樣會造成研究結果的不確定性。
去年在Nature Methods雜志上發表的研究“Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo”通過全基因組測序分析表明CRISPR基因編輯會引入數百種不可預估的突變到基因組中，文章所指出的大規模脫靶問題，對CRISPR的應用提出了尖銳的挑戰，卻又在今年3月30日出現反轉并進行了撤稿處理。值得注意的是，這篇文章的第一作者Kellie A Schaefer和共同第一作者Wen-Hsuan Wu均同意撤稿，而包括通訊作者Alexander G Bassuk以及Vinit B Mahajan在內的其余四位作者則不同意撤稿。這與通常的撤稿情況還是有所不同，一般的撤稿大多數情況貌似都是通訊作者要撤稿，這篇爭議性文章通訊作者則堅持了自己的意見。顯然，這篇文章在研究者們內部也有巨大分歧。
不過，也有研究表明，CRISPR的脫靶問題并沒那么嚴重：bioRxiv期刊上的研究“Whole genome sequencing of multiple CRISPR-edited mouse lines suggests no excess mutations.”指出，多個采用CRISPR/Cas9技術基因編輯的小鼠品系經過全基因組測序后的結果顯示，CRISPR/Cas9技術可在生物水平上精準地對基因組進行編輯，并沒有引入很多非預期的脫靶突變。
從以上這些充滿爭議性的研究可以看出，在應用CRISPR/Cas9技術時，其脫靶效應仍需謹慎考慮。綜合來看，現階段修飾準確、效果穩定、脫靶率極低的ES打靶技術仍是研究者的較優選擇。
CRISPR/Cas9技術目前難以勝任復雜的基因編輯
另一方面，對于復雜的基因修飾（如條件性敲除、條件性點突變和大片段敲入等），CRISPR有先天不足，因為此時需要Donor
DNA與受精卵中基因組的特定位置發生同源重組，而同源重組的效率很低。相反，ES打靶技術在這一方面因其flox區域范圍大、對于復雜結構寬容度高、打靶一次成功率高等特點，會有明顯的優勢。
CRISPR/Cas9專利之爭仍存爭議，商業化應用存在較大隱患
對于CRISPR/Cas9技術，還有一個值得關注的是其專利使用問題，CRISPR/Cas9專利是基于多家機構的研究成果，產權不明晰，一直存在所有權之爭。
2017年初，Broad研究所和合作者們被授權了關于真核生物細胞（包括人類細胞）的基因組編輯的CRISPR專利，而加州大學伯克利分校和合作者授權的專利是關于將CRISPR技術用于到cell-free系統中，并不是涉及真核細胞的基因組編輯。然而，后者對這一判決結果并不滿意，不滿意的結果就是啟動專利抵觸程序（interference
proceeding）。通過該程序一個發明者可以接手另一個發明者的專利。
來自咨詢公司IPStudies2017年的數據顯示，目前還有763項和Cas9相關的專利，在這些專利中，有些聲稱擁有某些CRISPR/Cas9基因編輯方面的專利權，隨著時間過去，這些專利的擁有者或許也會試圖去維護他們的權利。
CRISPR專利的紛爭給一些商業機構帶來了巨大的困惑。
首先，這意味著在未獲得CRISPR/Cas9技術專利授權的商業機構購買基于CRISPR/Cas9技術提供的技術服務和產品，存在著較大的法律風險；其次，很難保證從一家專利所有人購買的專利能覆蓋所有應用需求。
應用CRISPR/Cas9技術發表的文章數量和質量低于ES打靶技術發表的文章
通過Google學術搜索2013年至今有關CRISPR/Cas9基因敲除和ES打靶技術有關的文章，搜索knockout “embryonic stem cell” or “ES cell” 找到約17300條結果，搜索knockout “crispr” or “cas9” 找到約16100條結果。
針對兩個搜索結果，隨機抽檢搜索列表中的100篇文獻，統計分析后發現采用ES打靶技術發表的文章平均影響因子比CRISPR/Cas9技術發表的文章高2.1 IF。因此，不論從文章質量還是數量，目前CRISPR/Cas9技術的影響力仍弱于金標準的ES打靶技術。不過不可因此否認CRISPR/Cas9技術未來潛在的影響力。
綜合以上幾個方面來看， 近年來一直處于風口浪尖的熱點CRISPR/Cas9基因編輯技術已經出現過多次類似的“危機”，雖然有很多優勢，但學界仍需對其保持冷靜態度，隨著不同國家、不同地域的研究者們在CRISPR領域孜孜探索，也許這次一系列事件對CRISPR來說并非危機，反而是推動其發展的重要力量，我們也希望科學家們可以不斷去探索，優化工藝，以期將基因組編輯技術被更廣泛應用于臨床的疾病治療。
