阪崎腸桿菌核酸檢測試劑盒（一管式PCR-熒光探針法）
◆ 產品說明
阪崎腸桿菌核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）參照《SN/T 1870—2016 進出口食品中食源性致病菌檢測方法 實時熒光PCR法》進行設計，可針對食品樣品中阪崎克羅諾桿菌（阪崎腸桿菌）的特異核酸片段進行擴增，通過實時擴增曲線判定結果。該產品檢出限為10^3 cfu/ml（使用071021M細菌基因組DNA提取試劑盒提取1 ml 10^3cfu/ml增菌液的細菌基因組DNA作為模板）。
◆ 產品組成（ 96測試）
011122LⅡ | |
試劑 | 含量 |
A-ES-P | 20μL × 8管×12排 |
NG-P | 100μl×3支 |
PG-ES-P | 100μl×2支 |
◆ 適用儀器
熒光PCR儀（如ABI 7500）等可配套0.1 mlPCR八聯管的PCR擴增儀。
◆ 自備耗材和儀器
①滅菌1.5mL或2.0mL離心管；③冰盒；④移液器（1-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套滅菌吸頭；⑤離心機；⑥渦旋混勻器；⑦金屬浴；⑧均質機、攪拌機或研缽等研磨器具；⑨電子天平。
◆ 注意事項
1．本試劑檢測靈敏度高。為了防止污染，實驗要分區操作。
1）第一區：試劑準備區。
2）第二區：樣本制備區。
3）第三區：擴增及產物分析區。
★ 分區之間最好進行物理性隔離，避免人為因素造成的污染。
2. 實驗過程中穿戴工作服和乳膠手套，使用移液器，實驗產生的所有廢棄物及時處理。
3．嚴格按照操作步驟操作，試劑配制和加樣等步驟請嚴格按照說明書要求在冰上操作。
4．反應液中的成分對光敏感，應避光保存。試劑使用前剪下所需的測試數，解凍后使用前離心30秒。
5．反應結束后，擴增管請置于密封袋內丟棄，當日清理，開蓋易造成氣溶膠污染，禁止開蓋。
6．不同批號試劑請勿混合使用，在有效期內使用。
◆ 樣品處理
參照《GB 4789.40-2016 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）檢驗》進行阪崎克羅諾桿菌的樣品制備、增菌培養和分離。
◆ 實驗操作
1. 模板制備（樣本制備區）
建議使用試劑配套細菌組DNA提取系列產品，具體過程詳見產品說明書。
2．添加模板（樣本制備區，放置于冰盒中進行）
剪下所需測試數的已含有反應液的PCR管，放置在室溫待解凍后，離心30秒后揭開封口膜，使用穿刺加樣法穿過固封層向每管反應液中分別加入5μL模板，順序為NG、待測樣品模板、PG-ES-P。蓋好配套的PCR管蓋后，渦旋混勻30s，離心1min，立即進行PCR擴增反應。
3. 擴增反應（擴增及產物分析區）
使用熒光定量PCR儀，熒光基團選擇FAM，淬滅基團選擇TAMRA。
按下列條件設置擴增反應：
PCR循環 | 熒光收集位點 | ||
95℃ | 3分鐘 | 1個循環 | — |
94℃ | 5秒 | 40個循環 | — |
60℃ | 40秒 | ※ |
4.基線和閾值設定
基線調整取3-15個循環的熒光信號，閾值線應超過陰性對照擴增曲線的最高點。
◆ 結果判定
檢測樣品無Ct≥40，可報告樣品陰性，不含有阪崎腸桿菌或含量低于檢測限；
檢測樣品Ct ≤35，曲線呈“S”型擴增曲線，可直接報告樣品陽性，含有阪崎腸桿菌。
檢測樣品35＜Ct＜40，建議重復實驗。重復結果Ct≥40則樣品為陰性，否則為陽性。
NG反應為平滑直線，PG反應為“S”型擴增曲線且Ct值＜30，此次檢測結果有效，否則無效。如重復檢測結果仍為無效，請與技術支持人員聯系。
