MD酶標儀應用：細胞活力和毒性分析的原理和方法（一）

一、簡介

靶向細胞的科研研究和藥物研發避免不了細胞活力的分析和追蹤。但依據實驗的最終目的和關注參數的不同，細胞活力的體現，檢測方法也會不一樣。例如細胞增殖檢測適用于比較不同細胞株增殖能力，而細胞毒性分析則可以用于探究候選藥物是否有細胞毒性等。從分析儀器上來說，現階段主流的檢測平臺，如顯微鏡，流式細胞儀和實時熒光定量pcr儀等都可用于細胞活力的分析，但不同的平臺所關注的指標，靈敏度和通量會有所差異，因此需要依據所回答的生物學問題和指標選擇合適的檢測平臺。在上述平臺中，酶標儀提供了96、384孔板的高通量細胞活力檢測方法，靈敏度上能和經典的[3H]胸腺嘧啶摻入法(Thymidine Incorporation Assay)相媲美，因此成為了主流的科研和工業研發中細胞活力和毒性分析平臺。相應的，細胞活力分析也成為了酶標儀的基礎應用之一，也是Molecular Devices (MD)關注的主要應用。

在本手冊中，我們會從酶標儀出發向大家介紹，對比主流的細胞活力，毒性分析方法，并通過詳細的應用材料向大家展示如何應用MD酶標儀和軟件輕松，專業的完成細胞活力，毒性分析。

二、細胞活力分析

此部分主要關注常見的細胞活力分析方法，如MTT和ATP法等。雖然這些檢測方法也常用于分析藥物毒性和安全性，但相較于乳酸脫氫酶細胞毒性檢測等方法，它們更關注細胞活力的變化。依據原理的不同，細胞活力檢測方法主要分代謝法，酶活法和ATP法。

2.1 代謝法

2.1.1原理和介紹

代謝法是最常見的細胞增殖檢測方法，其主要包括四氮唑還原法(Tetrazolium reduction)，如MTT和CCK-8法等，和刃天青還原法(Resazurin Reduction)，如alamarBlue法等。這些方法的原理都是基于細胞的代謝能力還原孵育的底物，其產物通常具有光吸收或熒光屬性，因此能用酶標儀進行高通量細胞活力分析。

上述方法中，最常見的是MTT法，其屬于酶標儀光吸收應用，利用細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶對MTT的還原，形成不溶于水的結晶甲瓚(Formazan)并沉積在細胞中和細胞外。最后使用特定的有機溶劑，如二甲基亞砜(DMSO)等溶解后進行 570 nm處檢測[圖一]。由于MTT本身具有正電荷，因此容易進入細胞，并具有一定的代謝毒性。同時，確切上說，MTT法是檢測細胞線粒體的代謝活力。

圖一，MTT法原理，圖片來源于https://en.wikipedia.org/wiki/MTT_assay

近年來在MTT的基礎上一系列類似結構的底物被應用于細胞增殖活力檢測中，主要包括MTS, XTT, 和WST等，它們同樣屬于酶標儀光吸收應用。與MTT不同，這些底物本身具有負電荷，因此不易進入細胞，同時其還原產物可溶于水，因此無需溶解結晶步驟，提升了實驗的操作性和穩定性。該系列中，最常見的是基于WST-8的Cell Counting Kit-8(CCK-8法)。相較于僅依賴線粒體脫氫酶的MTT法，CCK-8法基于細胞內多數的脫氫酶，因此其檢測活力更為準確，靈敏度更高，同時降低了細胞毒性[圖二]。由于省去了溶解步驟，CCK-8法支持動力學檢測，提高了實驗的靈活性。同時因其毒性低，細胞在完成CCK-8法檢測后還可以用于后續的其他檢測。