影視作品《神探狄仁杰》中狄仁杰征求助手李元芳的意見從而借對話引出對案情分析的橋段,其中會包含對遇害者的情況分析診斷,也就是“古代法醫”的部分工作。
1247年(中國南宋理宗淳祜七年),時任湖南提點刑獄兼大使行府參議官的宋慈編寫完成《洗冤集錄》,這是世界歷史上第一本以死亡方式系統編輯的法醫學著作。
《洗冤集錄》開頭曰:“事莫大于人命,罪大莫于死刑,殺人者抵法故無恕,施刑失當心則難安,故成指定獄全憑死傷檢驗。倘檢驗不真,死者之冤未雪,生者之冤又成,因一命而殺兩命數命,仇報相循慘何底止。”故法醫最重要的工作便是提供醫學上的證據,協助檢察官、辦案者找出司法案件的真相,還原事實,保障死傷者的人權。
在現代,隨著科學技術的發展,法醫學已經成為一個復雜的開放系統,積極地吸收著來自數學、物理學、化學、生物學、心理學以及計算機科學與工程的知識,集現代科學技術體系于大成。特別是DNA檢測技術的發展和應用,為法醫學帶來了一場技術革命。
1985年英國Leicester大學遺傳學部教授A.J.Jeff reys發現并建立了DNA指紋圖的檢驗方法,于當年成功地鑒定了一宗英國移民糾紛案件。通過對遺傳物質DNA的序列多態性及長度多態性的檢驗,即可實現個體識別及親權鑒定,該技術正在成為當前法醫物證鑒定最主要的技術手段,被廣泛地運用于刑事犯罪偵查和親權爭議解決。
《中國測試》2017年7月刊發的《法醫DNA快速檢驗研究進展》,為國家重點研發課題和公安部技術研究計劃項目內容,就國內外法醫DNA-STR快速檢驗的研究進展和成果,分別從快速提取、快速擴增、快速設備、快速試劑與快速設備相結合四大方面對有關DNA快速檢驗概況的技術方法和實驗原理進行了充分說明和舉例論證,并對該行業在快速檢驗方法的選擇提出明確的建議。原文如下:
法醫DNA快速檢驗研究進展
董倩1, 李彩霞2, 趙蕾2, 郭瑜鑫1, 馬溫華2, 孫輝2, 葉健2, 李萬水2, 朱波峰1, 孫敬2
摘要:法醫DNA快速檢驗技術是目前研究的熱點,主要應用于個體識別和親子鑒定領域。該文分別從快速提取,快速擴增,快速設備,微流控芯片,全自動DNA分型檢測設備方面對現有DNA快速檢驗的技術方法,實驗原理進行充分說明和舉例論證,同時對該行業在快速檢驗方法的選擇問題上提出明確的建議——采用強抑制力的緩沖體系,高效酶并結合快速擴增程序實現快速PCR檢測技術,同時提出芯片化DNA檢測的實現方式,指出國產的便攜式全自動快速檢測儀器是未來發展的主要方向。
關鍵詞:快速檢驗快速PCR微流控芯片技術全集成
Advances in forensic DNA rapid test
DONG Qian1, LI Caixia2, ZHAO Lei2, GUO Yuxin1, MA Wenhua2, SUN Hui2, YE Jian2, LI Wanshui2, ZHU Bofeng1, SUN Jing2
Abstract: Forensic DNA typing technology has become a hot topic, mainly used in individual identification and paternity tests. This paper fully explains and illustrates the experiment principle about the forensic DNA test rapid research progress including rapid extraction, rapid amplification, rapid equipment, micro-fluidic chip technology and full integration. The author not only suggests that using strong suppression of buffer system, high efficiency enzyme and simultaneous rapid amplification can achieve rapid PCR detection technology but also puts forward the realization of chip DNA detection. Therefore the domestic portable automatic detection equipment is the main direction of the future development.
Key words: rapid testingrapid PCRmicro-fluidic chip technologyfull integration
0 引言
DNA分型在法醫學,親子鑒定,基因型分析等方面應用廣泛[1-2]。常規的法醫DNA分型通常包括DNA的提取、定量、擴增、純化、片段的分離和檢測,需要8~10 h,已無法滿足現有的需求。近年來國內外均通過各種方法來盡可能縮短DNA分型時間。本文就國內外法醫DNA-STR快速檢驗的研究進展和成果,分別從快速提取、快速擴增、快速設備、快速試劑與快速設備相結合4個方面對有關DNA快速檢驗的技術方法,實驗原理進行說明和舉例論證,并對該行業在快速檢驗方法的選擇上提出明確的建議。
1 生物檢材快速提取的研究現狀
DNA分型中,一般接觸性的檢材樣本DNA的提取通常要1 h以上[3],而且會因提取樣本差異,面臨諸多挑戰以及花費更長時間。在樣本提取的載體方面,法醫DNA最常用的載體是棉簽或者拭紙,它們共同點是對DNA的吸附性強,但損害大,且分布不均一。早在2007年孫海汐等[4]發現了一種微量DNA的快速檢驗技術:生理鹽水簌口法,可快速獲取足以滿足PCR擴增的DNA,并且便宜、方便;而棉簽取材不穩定,有一定吸附性,損害大,DNA含量少,牙簽效果則更差。在樣本提取所需環境方面,使用堿性裂解法可在5~10 min內快速提取常規的生物檢材,2010年袁自闖等[5]采用差異裂解法,同時結合脫氧核苷酸核酶DNase Ⅰ和堿性裂解法,調整溶液各成分的濃度及pH值,使用改良的堿性裂解液可在8 min內完成各類生物物證的提取,實現了快速獲得含有精斑的混合斑中的精子DNA。在樣本提取的試劑方面,Chelex 100最為常見,可用于全血、混合斑、毛發檢材,并在數分鐘內即可完成提取,但DNA純度不高。對于DNA含量少的檢材,通常采取M48磁珠法或是硅珠方法提取,2013年高林林等[6]利用PrepFiler Express BTA提取試劑盒結合AutoMate自動化法醫DNA提取工作站在3 h內實現了對骨粉和牙粉的裂解以及純化。在法醫DNA樣本提取的設備方面,一般體液樣本通常利用離心機分離DNA分子,或通過微型過濾器從流體樣本中抽提,需要20~30 min才能完成,并在提取過程中使用過多的有毒化合物。現今最新設備為2013年華盛頓大學的工程師聯合NanoFacture公司研發出的新型DNA提取設備——侵入流體樣本(唾液、痰液或血液)的顯微探針,通過在液體中施加電場,微型探針在其表面吸附DNA大小的顆粒,較大顆粒因擊中探針尖端而被彈開。采用這一技術,在3 min內就可分離和提純DNA分子。Ma C[7]用該顯微探針分別對4個不同來源樣本,包括細菌、酵母、人血和病毒進行了提取和比較,均可以獲得最大產量DNA,并進一步驗證了該新型顯微探針避開了傳統方法所有步驟,以更高效、環境更友好的簡單方式從流體樣本中提取DNA。
2 快速PCR擴增檢驗
快速PCR是指在保證PCR擴增反應結果準確性的前提下,盡可能地縮短PCR反應時間。國內外已經研發出各種商品化的試劑盒不同程度地縮短了PCR擴增時間。目前快速PCR的研究主要從對DNA聚合酶的改進、對緩沖體系(Buffer,Mix)的優化和改進以及結合快速擴增程序等方面來實現,主要表現為免提取的擴增檢驗和快速擴增檢驗兩方面。
2.1 免提取的擴增檢驗
免提取擴增又稱直接PCR。它是指將未經過處理的生物樣本直接加入PCR反應體系并獲得擴增產物[8]。免提取擴增檢驗針對的樣本是血液、血卡、口腔拭紙、唾液卡、棉簽、毛發根部等常規檢材,對于混合檢材和疑難降解檢材目前沒有研究。國內外早已有對全血DNA免提取而直接擴增的研究,Mercier等[9]在1990年就報道了全血擴增和以全血樣本提取DNA擴增的檢測具有同等效果。已上市的商品化直擴試劑盒針對的樣本均是血卡或是唾液卡。這些直擴試劑盒雖然會有位點選取和數目的差異,個體識別能力也不盡相同,并且對人群具有一定的選擇適用性,但相同點均是通過各自專用的酶及其配套的緩沖體系聯合相應擴增程序來實現快速檢測(見表 1[10])。2013年Flores S報道的GloberFiler Express[11]采用更強效的抗抑制緩沖體系和專用酶,同時結合優化的熱循環參數將PCR擴增時間縮短至40 min。Myers等[12]將PowerPlex?8D和Identifiler? Direct進行比較,雖然兩種直擴試劑盒的性能不一樣,但通過改變樣本DNA的量,調整循環參數和適當延長或減少毛細管進樣時間,最終使兩種試劑盒對同一樣本的檢測結果一致且分型準確。
表 1常用的直接擴增試劑盒
表選項