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  • 發布時間:2020-04-29 22:25 原文鏈接: 黃嘌呤氧化酶(xanthioneoxidase,XOD)試劑盒使用說明

    正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義:

    XOD(EC 1.17.3.2)催化黃嘌呤氧化生成尿酸和超氧陰離子,是活性氧主要來源之一;同時也是核苷酸代謝的關鍵酶之一。XOD 主要分布于哺乳動物的心,肺,肝臟等組織中,當肝功能受損時,XOD 大量釋放到血清中,對肝損害的診斷具有特異性的意義。

    測定原理:

    XOD 催化黃嘌呤產生尿酸,尿酸在 290nm 下有特征吸收峰。

    需自備的儀器和用品:

    紫外分光光度計/酶標儀、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96 孔板(UV 板)、研缽、冰和蒸餾水。

    試劑組成和配制:

    提取液:100mL×1 瓶,4℃保存;

    試劑一:30mL×1 瓶,4℃保存;試劑二:粉劑×2 瓶,4℃保存。

    粗酶液提取:

    1、細菌、細胞或組織樣品的制備:

    細菌或培養細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(104 個):提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復 30 次); 8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

    組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。2、血清(漿)樣品:直接檢測。

    操作步驟:

    1、 分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上,調節波長至 290nm,蒸餾水調零。

    2、 XOD 檢測工作液的配制:用時在每瓶試劑二中加入 15mL 試劑一,充分混勻,待用;現

    配現用;3、 測定前將 XOD 檢測工作液在 37℃(哺乳動物)或 25℃(其它物種)水浴 10min 以上。

    4、 準備 96 孔 UV 板一塊(非普通酶標板,普通酶標板只能透過可見光,不能透過紫外光,

    檢測波長小于 340nm 務必使用 UV 板)。

    5、在微量石英比色皿或 96 孔 UV 板中加入 10μL 樣本和 250μL 工作液,立即混勻并計時,記錄 290nm 下初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2。計算 ΔA=A2-A1。

    XOD 活性計算:

    a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

    1、血清(漿)XOD 計算:

    單位的定義:每毫升血清(漿)每分鐘催化產生 1nmol 尿酸定義為一個酶活力單位。

    XOD(nmol/min/mL)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷V 樣÷T=2131×ΔA

    2、組織、細菌或細胞中 XOD 計算:(1)按樣本蛋白濃度計算:

    單位的定義:每 mg 組織蛋白每分鐘催化產生 1nmol 尿酸定義為一個酶活力單位。

    XOD(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷(V 樣×Cpr)÷T =2131×ΔA÷Cpr

    (2)按樣本鮮重計算:

    單位的定義:每 g 組織每分鐘催化產生 1nmol 尿酸定義為一個酶活力單位。

    XOD(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T=2131×ΔA÷W

    (3)按細菌或細胞密度計算:

    單位的定義:每一萬個細菌或細胞每分鐘催化產生 1nmol 尿酸定義為一個酶活力單位。

    XOD(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=4.26×ΔA V 反總:反應體系總體積,2.6×10-4 L;ε:尿酸摩爾消光系數,1.22×104 L/ mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V 樣:加入樣本體積,0.01 mL;V 樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,1 min;W:樣本質量,g;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;500:細胞或細菌總數,500 萬。

    b. 96 孔板測定的計算公式如下

    1、血清(漿)XOD 計算:

    單位的定義:每毫升血清(漿)每分鐘催化產生 1nmol 尿酸定義為一個酶活力單位。

    XOD(nmol/min/mL)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷V 樣÷T=4262×ΔA

    2、組織、細菌或細胞中 XOD 計算:(1)按樣本蛋白濃度計算:

    單位的定義:每 mg 組織蛋白每分鐘催化產生 1nmol 尿酸定義為一個酶活力單位。

    XOD(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷(V 樣×Cpr)÷T =4262×ΔA÷Cpr

    (2)按樣本鮮重計算:

    單位的定義:每 g 組織每分鐘催化產生 1nmol 尿酸定義為一個酶活力單位。

    XOD(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T =4262×ΔA÷W

    (3)按細菌或細胞密度計算:

    單位的定義:每一萬個細菌或細胞每分鐘催化產生 1nmol 尿酸定義為一個酶活力單位。

    XOD(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=8.52×ΔA V 反總:反應體系總體積,2.6×10-4 L;ε:尿酸摩爾消光系數,1.22×104 L / mol /cm;d:96

    孔板光徑,0.5cm;V 樣:加入樣本體積,0.01 mL;V 樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,1 min;W:樣本質量,g;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;500:細胞或細菌總數,500 萬。


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