蛋白分離、雜交、檢測、分析
前瞻回顧
鑒于小編在《Azure Biosystems Western Blotting工作流程之實驗方法的選擇》中和大家聊了Western blot的實驗方法選擇，相信大家已經將您的western blot 實驗方法選擇好了，那么這期小編和大家聊聊western blot的實驗流程中的那些事。
蛋白分離
電泳準備？
玻璃配膠板要清洗干凈，以免引起配膠問題，影響蛋白分離
配膠液要充分混勻，凝聚時間要夠，如膠凝聚不均勻，會造成膠分辨率差。出現笑臉皺眉條帶
電泳時，上樣體積和濃度最好保持一致，這樣可以防止出現條帶過寬或者過窄的情況產生
如何選擇膜？
膜上有蛋白質的結合位點，可結合從凝膠中轉移的蛋白質。常用的膜是硝酸纖維素膜（NC膜）和PVDF膜。
NC膜
低分子量蛋白檢測
通常用于化學發光法
蛋白剝離效果不理想
PVDF膜
低表達蛋白結合能力強
通常用于熒光方法（自發熒光背景低）
剝離和二次雜交時，蛋白的截留能力強
如何建立轉膜系統
常用的轉膜系統形式為 “三明治” 結構，凝膠和膜緊密貼合，放在兩張轉印濾紙之間，用電極板夾夾住，置于轉印buffer中，正負電極通電后，將蛋白質從凝膠轉移到膜上。轉印濾紙 （濾紙） 能夠保持均勻一致的壓力，確保膜和凝膠間沒有空隙，并保持轉移buffer充盈在“三明治”結構中蛋白完全從凝膠轉移至膜上。
Blot前準備什么？
當優化轉印設置、條件及實驗時，最重要的是確定樣品中所有蛋白是否從膠上完全轉移到膜上。使用SelfStainTM免染膠來顯示膜上的所有蛋白 ，并立即進行western blot后續步驟。 
膜封閉
封閉目的是防止非特異性結合，降低背景對目的信號的干擾。如使用脫脂奶粉做封閉液，最好將脫脂奶粉進行濾膜過濾，這樣可以減少后期顆粒背景的產生。
一抗孵育
確保新的一抗濃度經過優化。如有確證過的一抗，可嘗試將一抗標記熒光染料，直接進行一步法Western blot檢測。
洗膜和二抗孵育
每次孵育后，洗去多余的抗體對于降低背景信號至關重要。熒光方法Western blot中，洗膜還可以去除有自發熒光的去垢劑。洗膜的時候如果多張，建議分開進行清洗，同時洗膜液體積不能太少。
化學發光檢測
嘗試不同的底物增加靈敏度和信號持久性；化學發光底物使用前需要平衡至室溫，可以增加酶的活性；數字成像系統要靈敏度很高。
熒光檢測
保持所有物品的清潔，確保無背景干擾；印跡膜避光保存；使用背景淬滅板降低背景熒光，增強信噪比。
檢測
Azure Biosystems c系列成像系統
Azure c 系列成像系統提供 4 款性能卓越的 Western blot 成像系統。可以選擇滿足現有實驗需求的型號，當需要提升應用范圍時，通過升級即可完成
