蛋白結合分析:將NOS固定OpenSPR的納米金芯片表面,并對CaM做濃度梯度檢測,結果導入TraceDrawer分析。
(圖4 )OpenSPR實時檢測,梯度稀釋后不同濃度檢測出野生型CaM對nNOS(紅線)和eNOS 肽(紫紅線)的結合情況,觀察結合、解離及再生的整個過程,結果顯示實驗曲線穩定及信號顯著。
(圖5) 不同突變的CaM 與cNOS結合數據導入TRACE DRAWER 軟件分析,獲取Koff、 Kon及 KD值,結果如下:
結果顯示:CaMcc與cNOS 的親和力高于wt CaM,相對wt CaM,所有突變型的CaM除了nCaM及CaMcc,與NOS解離速率都加快,并且結果與之前傳統方法得出只有CaMc能激活NOS,其他激活效果差或不激活的結果一致,也有效的證明了OpenSPR 在CaM 與cNOS結合研究中的準確性,并且檢測方法簡單,數據結果豐富,首次闡述了CaM激活cNOS激活機制是因CaM發生了EF手性對突變,利用這個方法下一步繼續驗證CaM激活eNOS及iNOS 的機制。
(1)Alderton etal.Biochem.J. (2001)357:593
(2) Babu YS,Bugg CE ,Cook WJ:J.Mol.Bio.(1988)204:191-204
(3) Spratt.D.E.et FEBS(2006)273,1759-1771
Nicoya OpenSPR個人型分子互作儀優勢:
·實時無標記
·實驗周期短:15min出結果,
·操作簡單---半個小時即可掌控
·實驗成本低---低成本儀器及芯片
·高檢測效率---上樣、出結果、一鍵式分析
·豐富的檢測數據:Ka、Kd、KD等