1.6樣本采集
恐懼實驗結束2h后，每組隨機選取6只小鼠，腹腔注射3.5%水合氯醛（10 mL/kg}麻醉，通過心臟灌注4%多聚甲醛固定腦組織，灌注完成后，取腦組織置于10%中性福爾馬林溶液中固定，用于病理切片制作。其余小鼠斷頭處死，迅速摘取大腦，分離海馬區，用于免疫組化及W estenl Blot檢測。
1.7HE染色觀察
固定好的腦組織經修整、脫水、包埋、切片、HE染色、封片等程序后，使用光學顯微鏡觀察小鼠海馬組織CA 1區組織結構的變化。
1.8免疫組化檢測
Bcl-2, Bax蛋白的分布及表達用T issue 0 C T-Freeze Medium包埋小鼠大腦并制作冰凍切片。嚴格按照SA B C免疫組化染色試劑盒說明依次固定、封閉、一抗孵育、二抗孵育、SA B C孵育、DAB顯色、二甲苯透明、中性樹膠封片，顯微鏡觀察，并用數碼醫學圖像分析系統進行數碼照相及圖片分析Bcl-2, Bax蛋白的分布及表達情況。
1.9Western Blot法檢測Bcl-2, Bax蛋白的表達
分離小鼠大腦海馬區組織，提取總蛋白，BCA試劑盒進行定量。取50 ug蛋白樣本，用15%的聚丙烯酞氨凝膠進行電泳80 V , 20 m in，之后轉換為120V、80 min;然后采用濕轉法進行轉膜300 m A、1 h;TB ST洗膜10 m in , 3次;5 % B SA常溫封閉 4 h;4 0C孵育一抗過夜;TBST洗膜10 m in , 3次;37 0C孵育二抗1 h; TBST洗膜10 m in , 3次;ECL進行發光，用ltu age L ab 3.0軟件對W estenl B lot成像圖進行分析，計算各組蛋白與內參(p-actin)的相對表達值。
1.10統計學處理方法
采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，數據以x士s”表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊性者使用LSD檢驗;方差不齊者使用D unnett' s檢驗。
2結果
2.1各組小鼠爬桿評分比較 爬桿實驗用于評價各組間小鼠肢體協調能力的差異。評分結果顯示:假手術組、模型組及各給藥組間均無明顯差異(P > 0.05 )，表明本研究采用的VD造模方法對小鼠的運動及平衡能力沒有造成影響，見表1 ;
2.2PHRE對小鼠條件恐懼記憶的影響 與假手術組比較，模型組小鼠的僵直時間百分比顯著縮短((P<0.09，表明VD模型復制成功，小鼠的記憶能力下降。與模型組比較，尼莫地平組及PH
R E中、高劑量組小鼠的僵直時間百分比明顯延長，差異具有統計學意義(P<0.09，表明PH R E在10-20
g/kg范圍內對VD小鼠的記憶能力有明顯的改善作用，見圖1
2.3毛冬青提取物對VD小鼠大腦神經元細胞形態的影響
病理組織學檢查顯示，假手術組小鼠大腦皮層和海馬區神經細胞的形態及分布未見異常。與假手術組比較，模型組小鼠神經細胞間質水腫，細胞核濃染、固縮，皮層神經細胞明顯減少，且伴有大量膠質細胞增生，多處聚集成堆，大腦海馬CA
1區的錐體細胞大量缺失、變性、壞死，齒狀回顆粒細胞變性成空泡樣。與模型組比較，PH R
E低、中、高劑量組和尼莫地平組小鼠的大腦神經元病變情況有明顯改善，體現為膠質細胞增生減少，海馬CA 1區錐體細胞病變程度明顯減輕，見圖2 ;
2.4免疫組化法檢測
VD小鼠海馬CA1區凋亡蛋白Bcl-2, Bax的分布和表達結果顯示，Bcl-2,
Bax呈不連續的環狀或者片狀分布，主要在胞質表達。與假手術組比較，模型組的Bc}2和B ax蛋白表達明顯增加。與模型組比較，尼莫地平組及PH R
E中、高劑量組的Bcl-2表達增加，B ax表達減少。表明VD模型小鼠的海馬CA1區神經元細胞發生凋亡，而在尼莫地平或PH R
E的干預下，凋亡現象減少，提示毛冬青提取物可以減少VD模型小鼠的海馬CA1區神經元凋亡的發生。見圖3- 5;
2.5 Western Blot法檢測VD小鼠海馬區Bcl -2 ,Bax蛋白的表達 Bcl -2水平的升高和B ax蛋白的降低表明細胞對凋亡的抵抗性增強，是藥物起保護作用的標志。Bcl -2 ,Bax的比值越大，則抗凋亡能力越強。結果顯示，與模型組比較，毛冬青提取物能提高VD小鼠海馬區Bc}2蛋白的表達水平，同時降低B ax蛋白的表達，即明顯升高Bcl -2 ,Bax的比值，表明毛冬青提取物可以提高VD小鼠海馬區細胞的抗凋亡能力，從而對VD小鼠海馬區的神經元起保護作用。見圖6 ;
3討論
本研究通過血流阻斷聯合放血法復制小鼠VD模型，經過小鼠智能測試及病理學檢查證實模型制備成功。實驗結果表明，VD模型組小鼠恐懼記憶時間縮短，且腦部海馬CA 1區神經元發生損傷，而毛冬青提取物能夠明顯提高VD小鼠的恐懼記憶時間，降低VD小鼠神經元細胞損傷的程度，結合其對凋亡蛋白Bcl -2 ,Bax的影響可以推斷，毛冬青通過抑制海馬CA1區的細胞凋亡而發揮神經保護作用。
大腦海馬區損傷會引起血管性癡呆，從而導致認知功能障礙。海馬體與大腦記憶有關，并且對腦缺血敏感Cio7。大量實驗結果表明海馬CA1區椎體神經元細胞的死亡會引起嚙齒類、靈長類動物以及人類出現認知功能障礙。因此，海馬CA1區錐體細胞對學習和記憶能力至關重要，然而CA1區對腦缺血尤為敏感，會引起嚴重的學習和記憶功能退化。病理實驗結果表明，VD模型組小鼠的大腦海馬CA 1區錐體細胞大量缺失、變性、壞死，并且齒狀回顆粒細胞變性成空泡樣。毛冬青提取物可阻止CA1區錐體細胞缺失，從而起到保護海馬區神經細胞，改善VD小鼠學習記憶的作用。
細胞凋亡在缺血再灌注損傷中具有重要的作用, Bcl -2 ,Bax屬于Bcl -2家族蛋白，調控細胞凋亡。Bc}2屬于抑凋亡蛋白，可以阻止細胞色素C從線粒體釋放到胞漿。B ax屬于促凋亡蛋白，通過移位到線粒體膜上促進細胞凋亡，促進細胞色素C的釋放。Bc}2通過平衡Bcl -2 ,Bax維持線粒體結構穩定。結果表明，與假手術組比較，模型組小鼠海馬區Bcl -2與B ax蛋白表達均有所升高，可能為小鼠大腦間斷缺血后，促凋亡蛋白B ax表達增加，誘導細胞凋亡，同時由于細胞自身的保護機制，抗凋亡蛋白Bc}2表達反應性上調，發揮抑制凋亡的作用。由于Bcl -2 ,Bax的比例決定細胞在受到凋亡信號刺激后是否發生凋亡，在VD小鼠模型中，B ax蛋白的表達占優勢，從而導致海馬區神經元細胞凋亡，海馬區形態受損，記憶力出現障礙;與模型組比較，毛冬青提取物能夠提高Bcl -2的表達，降低B ax的表達，從而顯著提高Bc}2啟ax的比值，使海馬CA1區細胞的凋亡受到抑制。因此，毛冬青提取物可以通過調節海馬CA 1區Bcl -2 ,Bax的表達，抑制CA1區的細胞凋亡，從而改善VD模型小鼠的學習記憶能力。
毛冬青已被廣泛應用于心血管系統疾病的治療，療效確切。近年來，也有學者深入探討毛冬青對腦組織損傷的保護作用。本實驗結果表明，毛冬青提取物在高劑量時，改善VD小鼠學習記憶障礙的效果與尼莫地平相似，可通過抑制VD模型小鼠的腦組織海馬區細胞凋亡來提高學習記憶能力，有望發展成為一種新的治療血管性癡呆藥物。